急性冠脈綜合征患者多種免疫細胞超活化的特征研究①

吳朝暉 錢 莘 韓志遠 雷奕祺 李海苗 侯 兵 林巧芬

(廣州醫科大學附屬武警醫院心內科，廣州510507)

急性冠脈綜合征患者多種免疫細胞超活化的特征研究①

吳朝暉 錢 莘②③韓志遠 雷奕祺 李海苗 侯 兵②林巧芬

(廣州醫科大學附屬武警醫院心內科，廣州510507)

目的：心肌梗死發生過程常伴隨宿主免疫細胞的激活和炎癥反應的發生。目前尚不清楚心肌梗死發生、進展過程中哪些免疫細胞被激活并參與其中。本研究旨在探討心肌梗死發生、進展過程中免疫細胞激活及其作用。方法：系統分析12例健康個體和55例心肌缺血患者，包括穩定性心絞痛患者(SA，n=13)、不穩定性心絞痛患者(UA，n=25)以及急性心肌梗死患者(AMI，n=17)外周靜脈血CD3 T細胞、CD4 T細胞、CD8 T細胞、NK細胞、CD4+NKT細胞、CD4-NKT細胞、CD3-CD56+NK細胞以及B細胞亞群的頻率及其活化標志CD38的表達情況。結果：研究發現，上述細胞亞群頻率在各組之間無顯著變化，但急性冠脈綜合征患者(ACS，包括UA和AMI患者)外周CD8 T細胞、NKT細胞以及NK細胞表達CD38水平顯著高于SA組患者及對照組，提示ACS患者多種免疫細胞被明顯激活，可能參與了ACS的病理過程。結論：ACS患者體內多種免疫細胞激活，可能與疾病的進展和轉歸密切相關。也為發現新的可能預測ACS進展的免疫標志物提供了一定的依據。

免疫細胞；免疫活化；急性冠脈綜合征

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是心肌梗死的首要病因，它不僅是單純的脂類失衡，而且是環境和遺傳的影響導致生物系統和免疫系統的分化[1]。心肌梗死發生、發展過程幾乎涉及每種免疫細胞；其中一些免疫細胞可導致動脈粥樣硬化和心肌梗死，而另一些可能防止相應的病變發生。因此免疫細胞在心肌梗死中的作用目前成為研究熱點[2]。免疫活化是免疫反應的必經之路，也是免疫反應的早期現象。以往研究表明：心肌梗死發生過程通常伴有宿主免疫細胞的激活和炎癥反應的發生[3]；但目前尚不清楚心梗發生、進展過程中哪些免疫細胞被激活。本研究系統分析了穩定性心絞痛、不穩定性心絞痛以及急性心肌梗死患者(后兩者被合稱為急性冠脈綜合征，ACS)外周血各類免疫細胞的激活情況，發現多種免疫細胞，尤其是NK細胞、NKT細胞以及CD8 T細胞在ACS患者被顯著激活。本研究對心肌梗死發生的免疫參與機制進行探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 本研究共募集55例心肌缺血患者和12例健康個體作為研究對象。根據個體疾病狀態分成4組：(1)健康對照組(Healthy control,HC)，12例，10名男性，2名女性，平均年齡(54.1±7.82)歲，心電圖均表現正常；(2)穩定性心絞痛組(Stable angina,SA)，13例，12名男性，1名女性，平均年齡(53.3±7.50)歲，臨床表現為胸部不適或發作性胸骨后或心前區胸痛，放射至左上肢，服用硝酸甘油可緩解；心電圖負荷試驗表現為水平或下斜型ST段壓低 <1 mm；(3)不穩定性心絞痛組(Unstable angina,UA)，25例，19名男性，6名女性，平均年齡(52.8±6.18)歲，臨床表現為心絞痛更劇烈，持續時間大于20 min，服用硝酸甘油可緩解；心電圖表現為ST段升高或連續兩個導聯壓低0.1 mm；(4)急性心肌梗死組(Acute myocardial infarction,AMI)，17例，15名男性，2名女性，平均年齡(51.2±5.54)歲，臨床表現為心絞痛持續時間大于30 min，肌酸激酶(CKMB)和肌鈣蛋白-Ⅰ(troponinⅠ)顯著升高。入組所有病例及對照均簽署知情同意書。研究對象的具體情況見表1。

表1 入組患者基本臨床數據

Tab.1 Basic clinical data for enrolled subjects

IndexHCSAUAAMIn12132517Age(year)5410±7825330±7505280±6185120±554Sex(male/female)10/212/119/615/2Smoker(%)7(5830)8(6150)11(4400)10(5890)Hypertension(%)6(5000)9(6920)11(4400)9(5290)Diabetes(%)5(4160)6(4620)10(4000)7(4130)BMI2520±4522630±3312640±3822490±296WBC(109L-1)487±035495±052494±035462±083TC(mmol/L)437±072416±091413±103395±087TG(mmol/L)214±092229±113172±084259±247LDL?C(mmol/L)213±056243±078249±090222±046HDL?C(mmol/L)093±027095±019096±022092±032GLU(mmol/L)645±123658±190622±174729±293Cre(μmol/L)7943±13908230±15308030±233011540±14120CRP(mg/L)162±188188±234534±9221)555±8821)CK(U/L)9270±536010200±4089070±4520127190±745101)CK?MB(U/L)1350±5601430±6301540±72021170±114301)CTnl(ng/ml)001±001001±002002±0061140±26501)LVEF(%)6530±7216250±6146300±6445740±1160LVEDD(mm)4760±5134880±6214690±3905050±383Medicationhistorybeta?blocker(%)2(1670)2(1540)3(1200)2(2220)ACEI/ARB(%)3(2500)5(3850)5(2000)4(2350)CCB(%)4(3330)8(6150)10(4000)9(5290)Statins(%)3(2500)5(3850)8(3200)8(4710)Aspirin(%)5(4170)7(5380)13(5200)9(5290)

Note：Compared with HC,UA and SA group,1)P<0.05.

1.1.2 主要試劑 鼠抗人CD4-BV421、鼠抗人CD3-BV500(美國Biolegend公司)，鼠抗人CD45-APC-Cy7鼠抗人CD56-APC、鼠抗人 CD38-PE、鼠抗人 CD19-PerCP-Cy5.5(美國 BD Pharmingen公司)。

1.2 方法

1.2.1 Ficoll-Hypaque密度離心法分離PBMC 取新鮮采集的肝素鈉抗凝血，離心去除血漿后，用PBS稀釋一倍，加至淋巴細胞分離液上層，2 500 r/min，離心25 min，取中間白膜層(即單核細胞和淋巴細胞富集層)，PBS洗滌2遍，得到外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。

1.2.2 流式細胞儀檢測各免疫細胞亞群組成及CD38分子在各亞群上的表達 將PBMCs計數后懸于含2%胎牛血清的PBS中，調整濃度為1.0×107細胞/ml。染色步驟如下：①取2支流式管，分別標記檢測管和對照管，均加入50 μl PBMCs懸液。②對照管加入抗體組合：CD45-APC-Cy7，CD3-BV500，CD56-APC，CD19-PerCP-Cy5.5，CD4-BV421和同型對照IgG1-PE，檢測管加入抗體組合：CD45-APC-Cy7，CD3-BV500，CD56-APC，CD19-PerCP-Cy5.5，CD4-BV421及CD38-PE，混勻后4℃避光20 min。③用2 ml含2%胎牛血清PBS洗滌液洗滌一次，1 200 r/min離心5 min后，棄上清。④兩管均加入1%多聚甲醛200 μl固定，2～8℃存放，避光待測。上流式細胞儀(FACS Verse，美國BD公司)分析前充分混勻細胞懸液，儀器參數設定后，使用相同電壓和熒光補償檢測各管樣本。每管樣本至少獲取20萬個有核細胞的熒光和散射光信號，使用Flowjo分析軟件進行淋巴細胞亞群及細胞活化指標CD38分析。

2 結果

2.1 患者基本情況 入組患者的主要臨床特征見表1。其中，年齡、性別、疾病危險因素(主要包括吸煙率、高血壓發生率、糖尿病發生率、BMI指數)以及部分臨床生化學指標、藥物使用等在各組之間無明顯差異。與對照組和UA、SA組比較，AMI組患者血漿CRP、CK、CK-MB、肌鈣蛋白(cTnl)水平顯著增加(P<0.05)。

2.2 流式圈門策略 首先，我們設定了流式染色方案(圖1)。根據前向角(FSC)和側向角(SSC)設定淋巴細胞亞群，選定CD45+白細胞。根據CD3和CD56，將外周的淋巴細胞分為4個群：CD3-CD56+NK細胞，CD3+CD56+NKT細胞，CD3+CD56-T細胞以及CD3-CD56-的其他細胞群，主要包括B細胞(CD19+)和其他未知的細胞群。最后，觀察各個細胞亞群上活化指標CD38的表達，其中NKT和T細胞又可根據CD4表達與否進一步觀察CD4+和CD4-的細胞亞群活化情況。

2.3 急性冠脈綜合征患者外周血免疫細胞亞群頻率無明顯變化 觀察了各個免疫細胞亞群在不同患者人群及健康人外周血淋巴細胞的頻率分布特點。結果發現，所有的免疫細胞亞群，包括CD3+T細胞(圖2A)、NKT細胞(圖2D)、NK細胞(圖2G)以及B細胞亞群(圖2H)在各組之間無顯著變化。但是，結果發現CD4+T細胞亞群頻率在UA患者較健康對照顯著升高(圖2B)，而CD8+T細胞亞群頻率在UA患者較健康對照顯著降低(圖2C)；但這兩種細胞亞群(CD4+T細胞和CD8+T細胞)在其他各組人群之間卻無明顯差異。同時，CD4+NKT細胞亞群(圖2E)和CD4-NKT細胞亞群(圖2F)頻率在各組之間也未發現有顯著差異。這些初步結果顯示，心絞痛患者外周血免疫細胞亞群并未發生顯著變化。

2.4 急性冠脈綜合征患者外周血淋巴細胞亞群廣泛激活 進一步分析了上述各個免疫細胞亞群的活化標志CD38的表達情況，發現UA組和AMI組患者外周CD8 T細胞(圖3C)，NKT細胞(包括CD4+NKT細胞,圖3E和CD4-NKT細胞,圖3F)以及NK細胞(圖3G)表達CD38水平顯著高于SA組患者及對照組(P<0.05)。結果還發現，SA組NK細胞CD38表達水平也顯著高于健康對照(圖3G)；而B細胞CD38表達水平在UA組顯著高于HC和SA組患者(圖3H)。但是，CD3 T細胞(圖3A)和CD4 T細胞(圖3B)CD38表達水平在各組之間無明顯差異。這些研究提示，急性冠脈綜合征患者(主要包括UA和AMI患者)外周多種免疫細胞，尤其是NK細胞，NKT細胞以及CD8 T細胞，被明顯激活。

圖1 免疫細胞亞群圈門策略Fig.1 Encirclement strategy of immune cell sub-group

圖2 各組人群外周血免疫細胞亞群的頻率Fig.2 Frequency of immune cell subsets in peripheral blood of different groupNote:*.P<0.05.

圖3 各組人群外周血免疫細胞亞群活化分子CD38表達情況Fig.3 Expression of activating molecule CD38 in peripheral blood immunocytes subsets in each groupNote:*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001.

3 討論

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)是一種涉及血小板、白細胞等多種炎癥細胞和因子的慢性炎癥反應[2,4]。在As發生、進展過程中，粥樣斑塊形成阻塞冠狀動脈，引起心肌缺血，導致SA；粥樣斑塊內炎癥反應進一步加劇，導致斑塊破裂、脫落，形成血栓，引起ACS的發生[5]。前期大量研究顯示，心肌梗死的發生、發展過程中，常伴隨著免疫細胞的激活和炎癥反應的發生[2,4]。這些免疫細胞聚集在粥樣斑塊內，相互作用，兼有損傷和保護作用。心肌梗死進展過程中哪些免疫細胞被激活目前尚不清楚。

本研究以HC和SA患者為對照，系統研究了ACS患者外周血CD3 T細胞、CD4 T細胞、CD8 T細胞、CD4+NKT細胞、CD4-NKT細胞、CD3-CD56+NK細胞以及B細胞亞群的頻率，發現各組之間上述外周血免疫細胞亞群頻率無顯著變化。這些結果與以往研究類似[6]，共同提示：ACS進展過程中，外周主要免疫細胞亞群未發生顯著變化。值得注意的是，我們發現UA患者外周血CD8 T細胞顯著降低，而CD4 T細胞顯著升高，提示這兩類細胞的平衡可能與ACS進展相關。將來的研究應該建立ACS患者長期隨訪隊列，調查CD4/CD8比值是否能夠作為預測疾病進展與轉歸的新的標志物。

免疫活化是免疫反應的必經之路，也是免疫反應的早期現象。以往研究已經表明：心肌梗死發生過程中，隨著斑塊破裂，心肌缺血壞死，ACS患者循環血炎性細胞因子水平升高[7-9]；這些炎癥因子間通過合成分泌的相互調節、受體表達的相互調控、生物學效應的相互影響而形成復雜的細胞因子網絡，影響ACS炎癥進程[10]。然而，炎癥因子的釋放通常是免疫細胞活化的結果，但目前仍不清楚哪些免疫細胞在ACS過程中被優先激活。本研究通過分析上述各個免疫細胞亞群的活化標志CD38的表達情況，發現ACS患者外周CD8 T細胞、NKT細胞以及NK細胞表達CD38水平顯著高于SA組患者及對照組(P<0.05)。這些結果說明，ACS患者多種免疫細胞處于激活狀態。這些激活的免疫細胞，一方面可能分泌各種炎癥因子或趨化因子，加快ACS炎癥進程；另一方面也可能分泌抑制性因子，包括IL-10或TGF-β，從而抑制過強的炎癥反應，減輕炎癥造成的組織損傷[9]。將來的研究應該重點解析以下幾方面的問題：(1)這些普遍激活的免疫細胞亞群，哪些是促進炎癥反應，哪些抑制炎癥反應？(2)活化的免疫細胞通過哪些因子分別參與到ACS的促炎和抑炎過程中？(3)免疫細胞被激活的時間順序如何？

重要的是，我們還發現，SA組NK細胞CD38表達水平也顯著高于健康對照。這個結果提示，心肌缺血早期NK細胞就可能被激活，參與到疾病的進展中。NK細胞是機體天然免疫細胞中最重要的一類細胞亞群，具有顯著的細胞殺傷、分泌細胞因子和免疫調節功能，與多種人類疾病的發生、發展及轉歸密切相關[11]。NK細胞根據CD56和CD16表達情況，分為CD3-CD56highCD16-亞群，CD3-CD56lowCD16+以及CD3-CD56-CD16+等3個亞群，每個亞群的功能有顯著差異。NK細胞的功能，一方面受到其表面多種活化或抑制性NK受體的調節，另一方面還受到多種細胞因子，包括IL-12、IL-15、IL-18以及IFN-α等因子調節[12]。近年來NK細胞功能活化與ACS的關系已經開始受到關注[13,14]。以后的研究應該重點關注ACS發生過程中，NK細胞如何被激活，激活的NK細胞如何參與ACS病理機制等。

本研究也有兩個不足。第一、本研究是個斷面研究，未能對ACS患者進行長期隨訪，因此未能發現心肌缺血進展過程中，免疫細胞亞群激活的時序性。建立SA患者隊列，并長期隨訪到ACS發生，有可能深入闡明機體免疫應答與ACS發生、發展及轉歸的密切關系。第二、本研究只檢測了患者外周血免疫細胞的頻率及活化狀態，未能闡明粥樣斑塊內浸潤免疫細胞亞群的種類及免疫特性[6]。將來的研究應該重點闡明斑塊內的免疫反應，這將對于闡明斑塊的形成及破裂機制具有重要意義[15]。

總之，本研究發現ACS患者外周血多種免疫細胞被激活，可能與疾病的進展密切相關，也為發現新的可能預測ACS進展與轉歸的免疫標志物進行了有益的探索。將來的研究應該建立長期隨訪隊列、仔細探討斑塊局部的炎癥機制，從而闡明機體免疫應答在ACS進展中的時空特性及參與機制，為探索新的免疫治療手段提供依據。

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[收稿2016-03-02 修回2016-04-13]

(編輯 張曉舟)

Immune hyper-activation of multiple lymphocyte subsets in acute coronary syndrome

WU Zhao-Hui,QIAN Shen,HAN Zhi-Yuan,LEI Yi-Qi,LI Hai-Miao,HOU Bing,LIN Qiao-Fen.

Department of Cardiology,Wujing Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University,Guangzhou 510507,China

Objective:The process of myocardial infarction is generally characterized by the activation of host immune cells and the occurrence of inflammation.However,it is unknown which immune cells are preferentially activated and participated into the progression of myocardial infarction.Methods:A total of 55 patients with myocardial ischemia including 13 of stable angina (SA),25 of unstable angina (UA) and 17 of acute myocardial infarction (AMI) as well as 12 of healthy controls (HCs) were enrolled in the study.The frequency and the immune activation marker CD38 expression by peripheral CD3 T cells,CD4 T cells,CD8 T cells,CD4+NKT cells,CD4-NKT cells,CD3-CD56+NK cells and B cells were comprehensively analyzed.Results:There was no significant difference in the frequencies of these immune cell subsets in peripheral blood among these four groups.Importantly,it was found that CD38 expression was significantly increased on CD8 T cells,NKT cells and NK cells in patients with acute coronary syndromes (ACS) including UA and AMI patients as compared with those in SA and HC subjects.These data indicated that multiple immune cells were activated in ACS patients,which were possibly participated into the pathogenesis of ACS.Conclusion:The activation of multiple immune cells was closely associated with the progression and outcome in ACS patients.This study provides immune hyper-activation mechanism underlying the development of ACS and may favor for finding a novel immune marker to predict the progression of ACS.

Immune cells;Immune activation;Acute coronary syndromes

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.020

①本文受中國醫師協會陽光心血管研究基金(No.SCRFCMDA-201314)資助。

吳朝暉(1965年-)，男，碩士，副教授，主要從事心血管病基礎與臨床研究，E-mail:zhwugz@126.com。

R541

A

1000-484X(2016)12-1815-05

②廣州醫科大學附屬武警醫院腫瘤科，廣州510507。

③通訊作者，E-mail：qianshen7@aliyun.com。