G-CSF動員干細胞對淋巴細胞的影響

劉耔序 綜述 張學軍 審校

(河北醫科大學第二醫院，石家莊050000)

G-CSF動員干細胞對淋巴細胞的影響

劉耔序 綜述 張學軍 審校

(河北醫科大學第二醫院，石家莊050000)

目前，利用粒細胞集落刺激因子(Granuloctye colony stimulating factor ，G-CSF)動員的造血干細胞作為移植物應用于外周血造血干細胞移植已經被廣泛用于治療惡性血液病，已有的研究證實G-CSF作為動員劑是安全、有效的[1]。移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease，GVHD)是指供著來源的淋巴細胞攻擊患者的器官引起的臨床病理綜合征，它是異基因造血干細胞移植后的主要并發癥之一。與骨髓移植相比，外周血干細胞移植物中含有更多的淋巴細胞，但急性GVHD(acute GVHD，aGVHD)發生率和嚴重程度并不明顯高于骨髓移植，而慢性GVHD(chronic GVHD,cGVHD)發生率則有升高。提示作為動員劑的G-CSF能對淋巴細胞產生影響，進而改變GVHD的發生情況。隨著研究的逐漸深入,G-CSF動員對供者淋巴細胞的影響和其對造血干/祖細胞的動員效果一樣受到了重視，本文就此方面做一綜述。

1 淋巴細胞表面G-CSF受體表達的相關研究

人粒細胞集落刺激因子受體(G-CSF receptor,G-CSFR)是一種跨膜蛋白，由813 個氨基酸構成，相對分子質量為 130 000～150 000道爾頓。由于與之相對應的mRNA的剪接方式的不同，它有7種不同的異構體[2]，G-CSF通過與G-CSFR結合而發揮其生物學作用，如刺激粒細胞系的增殖、分化，動員骨髓中造血干/祖細胞進入外周血等。G-CSFR高度表達于造血干/祖細胞和中性粒細胞系，在單核-巨噬細胞呈中等水平表達。許多研究表明，G-CSFR在T、B淋巴細胞及部分幼稚淋巴細胞表面也有表達，并且不同類型淋巴細胞表達有差異。也就是說，G-CSF不僅是造血干細胞及固有免疫的調節劑，也可以在淋巴細胞介導的適應性免疫中發揮多效性作用[3]。Morikawa等[4]曾對取自慢性扁桃體炎和免疫性血小板減少癥的患者的扁桃體、脾臟、骨髓、臍帶血及外周血的淋巴細胞進行了研究，從蛋白水平和RNA水平都證明了人體內正常的淋巴細胞也可以表達G-CSFR，且不同的淋巴細胞表達程度有差別。在臍血和外周血的標本中，表達G-CSFR的B淋巴細胞在其表面多數也表達免疫球蛋白D(sIgD+),在sIgD-的B淋巴細胞中G-CSFR表達很少，而前者多為幼稚B細胞,后者多為記憶B細胞。在扁桃體標本中，表達G-CSFR的B細胞多位于生發中心和外套層，在記憶B細胞區域很少，提示B細胞在分化成熟過程中，其G-CSFR表達能力會下調。他們的這一研究還提示，B細胞對G-CSFR的表達是基本存在的，而T細胞的G-CSFR表達則需要誘導。Franzke等[5]在單個細胞水平上證明了CD3+、CD4+、CD8+T細胞均可表達G-CSFR，但需要G-CSF進行誘導后才能檢測出，表達強度呈時間依賴性。薛勝利等[6]在此基礎上等對22例健康人外周血有核細胞膜表面G-CSFR進行了定量檢測，再次證實了淋巴細胞表面表達G-CSFR。進一步地對不同的淋巴細胞亞群及其他外周血有核細胞表面G-CSFR表達密度進行組間比較，中性粒細胞、單核細胞與 T 淋巴細胞間G-CSFR表達密度無統計學差異;淋巴細胞與其他細胞及 B 淋巴細胞與其他細胞間G-CSFR 表達密度存在統計學差異(表1)。

他們的研究還發現，盡管從整體而言，淋巴細胞G-CSFR受體表達程度明顯弱于髓系細胞，但其中CD19+B 淋巴細胞呈高表達G-CSFR，在其中的一些標本中超過了髓系細胞水平。綜上所述，淋巴細胞表面表達G-CSFR，并且不同亞群之間存在較大差異，提示G-CSF可以直接作用于淋巴細胞，并影響相應的免疫功能。也說明在G-CSF動員造血干細胞的過程中，相應的淋巴細胞亞群也會受到影響。

2 G-CSF動員對T淋巴細胞的影響

2.1 G-CSF動員改變T細胞亞群構成 人體內成熟T細胞根據表面標志可分為CD4+T細胞(Th細胞)和CD8+T細胞(Tc細胞)，根據其分泌細胞因子的不同又可分為分泌 IFN-γ、TNF-α的 CD4+T細胞(Th1) 和 CD8+T細胞(Tc1)的Ⅰ型 T細胞,和分泌 IL-4、 IL-5和 IL-10的 CD4+T細胞(Th2)和 CD8+T細胞(Tc2) 的Ⅱ型 T細胞，分泌IL-17、IL-21的Th17細胞，此外還有負性調節T細胞免疫功能的T調節細胞(Treg)。

表1 正常人外周血各類有核細胞膜表面 G-CSFR 表達密度比較結果

Tab.1 Comparison results of G-CSFR expression density of nucleated cells between different cell group in peripheral blood from healthy people

NeutrophilMonocyteT?celllymphocyteB?celllymphocyteNeutrophil28562/00910320006/<0000112694/02599299113/<00001Monocyte-278926/<0000132667/00707162997/<00001Lymphocyte--296551/<00001322667/<00001T?celllymphocyte---266667/<00001

Note：Data format,χ2/P.

如前所述，G-CSF動員可以引起T細胞亞群的改變，進而調節免疫功能， Tayebi等[7]研究發現：造血干細胞移植供者應用G-CSF后，外周血淋巴細胞絕對值明顯增高，同時提升了單核細胞與T淋巴細胞的比值，但是CD4+,CD8+,CD45RO+T細胞的比例無明顯變化，動員前后周血中CD4+/CD8+比值也無明顯差異。而與外周血移植物相比，骨髓移植物中的CD4+T細胞比例較低，以致骨髓中CD4+/CD8+呈倒置狀態。然而兩者的初始T細胞(CD45RA+)和記憶T細胞(CD45RO+)百分比保持接近。研究還發現：外周血移植物中T細胞活性標記(CD95、CD25、HLA-DR)陽性的T細胞比例要小于骨髓移植物。表示外周血移植物中的T淋巴細胞活性較低。Tayebi等[7]的研究還提示G-CSF動員使外周血CD3+淋巴細胞中CD3+IFN-γ+細胞比例減少，也可以在單個細胞水平減少IFN-γ的產生，對IL-4+細胞則無明顯影響。這就使得動員后體內I、Ⅱ型T細胞因子比例發生變化。Ⅱ型細胞因子又可以使得T淋巴細胞亞群朝Th2細胞極化，最終減小aGVHD的發生率和嚴重程度。也有研究指出，G-CSF動員后，供者CD4+T細胞分泌IFN-γ和IL-4水平均下降[8]，且I/Ⅱ型因子并無明顯差異，目前機制不明，還應當進一步研究其對相關信號通路的影響。

G-CSF除影響Th1、Th2細胞亞群外，也可通過減少Th17細胞分化而影響aGVHD的發生，但目前研究結果不一致。Joo等[9]的動物實驗表明，G-CSF可以通過上調Th17分化的抑制因子——細胞因子信號轉導抑制分子3(Suppressor of cytokine signaling,SOCS-3)表達的方式來減弱CD4+T細胞向Th17細胞分化。進而減少IL-17等細胞因子數量，最終減弱Th17細胞介導的皮膚aGVHD。但是此項研究還提示G-CSF動員并不影響Th1、Th2細胞分泌的相關細胞因子水平，這與前文所述不一致。Hill等[10]的研究還得出了與之相反的結果：CD4+T細胞和CD8+T細胞IL-17分泌能力在G-CSF動員后均增加，且IFN-γ、TNF等細胞因子水平也有輕度增加。造成這些結果互相矛盾的原因尚需闡明。G-CSF動員對Treg(CD25+FoxP3+)功能也有影響，有研究表明，G-CSF動員后的，血細胞FoxP3蛋白表達增加，CD25陽性細胞在外周血單個核細胞中富集，可能對移植中巨細胞病毒感染有治療作用[11]。MacDonald等[12]研究發現,如果在G-CSF動員后的移植物中去除自然調節T細胞(CD4+CD25+)后，極易誘發GVHD，說明G-CSF動員過程中該亞群活性受到影響。通過實時PCR技術可知該亞群高度表達白細胞介素-10受體(IL-10R)，因此該過程可能與IL-10相關。

此外，Smith-Norowitz等[13]對一例患有過敏性哮喘的造血干細胞移植供者G-CSF動員前后各淋巴細胞亞群數量進行研究時發現其中的CD8+CD60+T細胞亞群動員后的增值率比其他大多數亞群高，且下降較慢。該亞群可以負性調節人體內IgE的水平，因此該例供者相應出現了體內IgE水平的一過性下降。說明與常規淋巴細胞亞群相比，G-CSF更多的改變了淋巴細胞的功能性亞群。

2.2 G-CSF動員對CD4+T淋巴細胞表面分子表達的影響 汪菲等[8]對健康供者動員前后CD4+T表面分子的研究證實，G-CSF動員后，供者體內CD4+T細胞表面L-選擇素(L-Selectin LAM-1 CD62L)、細胞間黏附分子-1(Intercellular adhesion molecule，ICAM-1)在G-CSF動員后表達下降。CD62L是 T 細胞與內皮細胞相互作用的歸巢受體，G-CSF動員后其表達的降低，可能減弱 CD4+T 細胞植入受者后的歸巢能力，阻礙其進入外周淋巴器官或靶器官。ICAM-1表達下降則提示G-CSF可能影響了LFA-1/ICAM-1 信號通路，進而影響CD4+T細胞的極化和黏附功能。隨后趙莎莎等[14]利用獻血者標本進行體外細胞實驗，進一步證實了G-CSF直接刺激能夠抑制CD4+T細胞的黏附、極化功能，也證明 G-CSF 可能直接通過淋巴細胞上的 G-CSF 受體發揮調控作用。該研究還發現動員前后 CD4+T 淋巴細胞向基質細胞衍生因子-1 (SDF-1α) 遷移能力差異無統計學意義，也不影響CD4+T細胞表面黏附分子受體人整合素4(VLA-4)的表達。SDF-1α對T細胞具有趨化作用，增強其遷徙能力，并激活微血管內皮細胞表達VLA-4的相應配體血管黏附分子-1 (VCAM-1) 而通過VLA-4/VCAM-1途徑使淋巴細胞完成跨內皮移動。從這一點上來說，G-CSF不影響CD4+淋巴細胞的遷移功能。但是Singh等[15]的研究指出，受到G-CSF刺激而大量增殖的中性粒細胞可介導間充質干/祖細胞(Mesenchymal stem/progenitor cells，MPC)和成骨細胞(Osteoblasts， OB)凋亡，減少包括SDF-1α和VCAM-1在內的相關因子。這可能會間接影響到T細胞的相關功能。

G-CSF動員也會影響到T細胞表面抗原識別受體(T cell receptor,TCR)的表達，Ritter等[16]研究發現，與動員前相比，供者接受動員后體內CD4+T細胞的TCR多樣性下降，這與移植過程中EB病毒和巨細胞病毒的活化關系密切，對GVHD的影響尚不明確。

3 G-CSF動員與B淋巴細胞

3.1 B淋巴細胞參與干細胞動員的過程 在G-CSF在動員過程中，骨髓重構平衡被打破(具體機制不明)，位于骨內的成骨細胞減少，同時SDF-1、骨橋素、干細胞因子(Stem cell factor ，SCF)等骨髓基質成分減少，最終造血干細胞持續離開骨髓而進入外周血。最近Li等[17]利用B6.129-Cd3etm1Lov、B6.129P2(C)-Cd19tm1(cre)Cgn和C57BL/6三系小鼠(分別為T細胞缺陷、B細胞缺陷、正常對照)進行G-CSF動員對照實驗，給予G-CSF后，B細胞缺陷小鼠動員后白細胞計數明顯低于其他兩系。這就提示B淋巴細胞參與了造血干細胞動員的過程。在B淋巴細胞缺陷的小鼠動員后，體內SDF-1和骨橋蛋白比其他兩系要高，說明B淋巴細胞，而非T淋巴細胞在G-CSF介導的成骨細胞抑制過程中充當“中介者”的身份。進一步以10名造血干細胞移植健康供者的動員前后的骨髓標本為材料，用Western blot方法證實：G-CSF動員后，骨髓內B淋巴細胞Dkk蛋白表達增加了10倍。Dkk蛋白是Wnt信號通路中的一種關鍵的調節因子，其增加可抑制成骨細胞。此研究再次證實了G-CSF可以通過相應受體直接作用于B淋巴細胞增強其生物學功能，也說明B淋巴細胞參與了HSC動員的過程。

3.2 G-CSF對B淋巴細胞作用的兩面性 Huston等[18]對X染色體相關的重癥聯合免疫缺陷的(X-linked severe combined immunode ciency,SCID-X1)小鼠模型研究發現：在進行干細胞移植治療前，予以受體G-CSF預處理，可以改善B細胞的免疫重建，可以彌補移植后遺留B功能不全的問題。這可能因骨髓在G-CSF動員過程中出現了臨時的一部分“空白區域”，使移植物中相關細胞得以定植。但這一現象只在實驗室條件下明顯，而在臨床則因SCID-X1患者體內存在非功能性的B細胞，它們對移植物中的前體B細胞植入有阻礙作用。但是，成熟的B細胞不占用骨髓微環境，前B細胞只在某些特定的骨髓微環境中出現，足夠的移植物可能使得正常B細胞成功與SCID患者中的缺陷B細胞競爭，從這一點上來說，G-CSF的這一調節作用在臨床上仍可能有效。

另一方面，由于G-CSF在動員中改變骨髓微環境，造成骨髓內SDF、IL-6、IL-7、胰島素生長因子-1等B細胞營養因子表達下降，間接的對骨髓B淋巴細胞起到一定的抑制作用。Day等[19]利用CD68:Csf3r Csf3r-/-轉基因小鼠(G-CSFR僅在單核-巨噬細胞系表達)進行體內實驗。發現給予該系小鼠G-CSF動員后，骨髓內B淋巴細胞明顯下降，且IL-7、IL-6、B細胞活化因子(B cell activating factor,BAFF)mRNA水平也下降。Winkler等[20]的研究也有相似結果。

G-CSF動員后，骨髓中各個發育階段的B細胞均下降，盡管有部分前期B細胞和前B細胞轉移到外周血和脾組織中，也不能補償這種減低作用。動員結束后，骨髓中B細胞開始恢復，這時外周血的B細胞呈明顯增多趨勢。這些研究還指出G-CSF動員會增加B細胞的凋亡。綜合上述研究，G-CSF對B細胞影響機制復雜，既可以直接作用于B細胞而上調其某些生物學功能，同時也通過改變相關細胞因子而間接對B細胞起到抑制性作用，具有兩面性。

4 小結與展望

G-CSF作為一種安全、有效的干細胞動員劑，在外周血造血干細胞移植中有著不可替代的作用。它同時還是一種免疫調節劑。如前所述，G-CSF可以在細胞和分子水平，直接或者間接地影響淋巴細胞的數量、亞群構成以及功能活性，并最終影響GVHD的發生。隨著研究的逐漸深入，與常規淋巴細胞亞群分類相比，它對某些有特定功能的淋巴細胞亞群的影響得到重視，但G-CSF對aGVHD更為具體的影響機制目前尚待闡明。此外，與T淋巴細胞相比，目前在臨床水平上對造血干細胞移植供者動員前后B細胞及其亞群變化的研究較少，B細胞在GVHD中的作用亦有待研究。對G-CSF影響淋巴細胞更深入的研究可能對自體造血干細胞移植患者使用G-CSF后對原發病的影響及實體瘤化療后粒細胞減少患者使用G-CSF對原發病的影響有更清晰的了解。

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[收稿2016-01-26 修回2016-05-11]

(編輯 許四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.036

劉耔序(1991年-)，男，在讀碩士，主要從事造血干細胞移植研究。

及指導教師：張學軍(1963年-)，女，博士，碩士生導師，教授，主任醫師，主要從事造血干細胞移植研究，E-mail： zhxjhbmu@126.com。

R392.5

A

1000-484X(2016)12-1885-04