allo-HSCT受者細胞因子基因多態性與急性移植物抗宿主病的關系①

金雪峰 葉冬梅 藍 梅 陳 英

(廣西壯族自治區人民醫院，南寧530021)

allo-HSCT受者細胞因子基因多態性與急性移植物抗宿主病的關系①

金雪峰 葉冬梅 藍 梅 陳 英

(廣西壯族自治區人民醫院，南寧530021)

目的：探討在異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素10(IL-10)、轉化生長因子β1(TGF-β1)、干擾素γ(IFN-γ)等多種疾病相關細胞因子基因多態性與急性移植物抗宿主病(aGVHD)的相互關系。方法：選取2014年1月至2015年12月進行allo-HSCT的受者32例及正常人群36例作為研究對象，采用聚合酶鏈式反應(PCR)聯合基因測序對目的基因特殊SNP位點基因分型進行檢測，觀察受者術后出現aGVHD的不同情況，分析細胞因子基因多態性對allo-HSCT預后的影響，探討疾病相關細胞因子特殊SNP點突變與aGVHD發病嚴重程度的潛在相關性。結果：在全部allo-HSCT受者中，TNF-α-308(G/A)、IL-6-174(G/C)、IL-10-1082(A/G)、TGF-β1+915(G/C)、IFN-γ+874(T/A)等細胞因子的基因多態性分布與重度aGVHD的發生率未見有顯著性的差異(P>0.05)。在TGF-β1+869SNP位點上，C/T型allo-HSCT患者中重度aGVHD發病率顯著高于C/C、T/T兩個基因型患者組(P<0.01)。結論：在allo-HSCT患者中TGF-β1+869(C/T)基因多態性與aGVHD發病的嚴重程度具有密切聯系。C/T型allo-HSCT患者更容易發生重度aGVHD，是誘發嚴重aGVHD出現的潛在危險因素。因此，在allo-HSCT患者中針對TGF-β1+869(C/T)進行基因多態性檢測，制定合理的aGVHD預防方案，可能有助于減少減輕aGVHD的發生。

異基因造血干細胞移植；細胞因子；基因多態性；急性移植物抗宿主病；個體化給藥

異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)是血液系統惡性疾病有效乃至唯一根治的手段，同時也是部分惡性腫瘤、遺傳性疾病和自體免疫性疾病的有效治療手段。急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease，aGVHD)作為allo-HSCT最常見的嚴重并發癥,嚴重影響干細胞移植的預后[1,2]。

在aGVHD的發生機制中，“細胞因子風暴”學說占據重要地位，國內外相關研究提示異基因造血干細胞移植供者和受者中多種細胞因子基因的單核苷酸多態性與aGVHD的發生可能具有潛在的聯系。這些細胞因子的合成及分泌水平受遺傳基因所調控，具有個體差異。其主要原因在于細胞因子基因調節區或啟動區的多態性。因此，移植前檢測受者的細胞因子基因多態性有助于指導合理制定免疫抑制方案。其中，腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白細胞介素10(Interleukin-10,IL-10)、白細胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、轉化生長因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、干擾素γ(Interferon-γ,IFN-γ)基因多態性被認為與GVHD密切相關[3-7]。上述基因的不同分型可能與aGVHD的發生程度及預防藥物的代謝情況存在相互關系，但該方面尚未見相關研究報道。

本文旨在通過檢測異基因造血干細胞移植受者TNF-α、IL-10、IL-6、TGF-β1、IFN-γ的基因多態性，分析其與aGVHD存在的潛在聯系，為根據疾病相關細胞因子基因分型確定合理免疫用藥方案，提高異基因造血干細胞移植術后移植物存活率及血液系統惡性疾病患者療效提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 選取2014年1月至2015年12月間進行allo-HSCT患者32例作為研究對象，其中女性患者10例，男性患者22例。36例正常人群中包括女性13例及男性23例。allo-HSCT患者篩選標準為供、受者人類白細胞抗原(HLA)配型均完全相合，所有受者采用的移植預處理方案及預防GVHD藥物一致，輸注有核細胞數量及原發病等比較，差異均無統計學意義。受者均無感染、輸注供者白細胞，配型不合等誘因，均未進行骨髓去T細胞處理。

1.1.2 試劑和實驗儀器 Golden Easy PCR System[KT221-02，天根生化科技(北京)有限公司]；pBR322 DNA/Mspl Marker[MD206，天根生化科技(北京)有限公司]；血液基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Blood DNA Kit)[DP318-02，天根生化科技(北京)有限公司]；凝膠核酸染料 GelRed Nucleic Acid Stain,10000Xin water 0.5 ml(13G0307，美國Biotium公司)。PowerPac基礎電泳儀(Bio-Rad laboratory)；S100梯度PCR儀 (美國)；Genegenius凝膠成像系統(南寧友寧科技有限公司)

1.2 方法

1.2.1 預處理及預防GVHD方案

1.2.1.1 預處理方案 32例患者均采用改良的BuCy方案 羥基脲40 mg/kg口服，1次/10 h，共2次(術前10 d)；阿糖胞苷(Ara-C)1～2 g/m2靜脈滴注(術前9 d)；白消安1 mg/kg口服，1次/6 h(術前8、7、6 d)；環磷酰胺(CTX)1.8 g/m2靜脈滴注(術前5、4 d)，司莫司汀(Me-CCNu)250 mg/m2口服(術前3 d)。

1.2.1.2 預防GVHD方案 所有患者均采用甲氨蝶呤(MTX)+ CsA方案預防GVHD。患者于移植前1 d開始靜脈滴注CsA，劑量為3 mg/(kg·d)，持續24 h靜滴。待消化道癥狀消失后改為口服(約30 d)，按6 mg/(kg·d)。

1.2.1.3 aGVHD分級 aGVHD的嚴重度分級是以器官受累類型和臨床征象確定的。本文分級標準采用西雅圖Glucksberg[8]分級系統，其程度分成輕度(0～Ⅰ度)和重度(Ⅱ～Ⅳ度)。

1.2.2 基因型檢測

1.2.2.1 血樣采集及DNA提取 對allo-HSCT受者及正常人群外周血進行采集，每人取3～5 ml于EDTA抗凝管中，4℃保存。基因組DNA的提取采用TIANGEN公司的離心柱型血液基因組DNA提取試劑盒對血樣中的基因組DNA進行提取。

1.2.2.2 引物設計 引物分別參照GenBank中目的基因序列及相關文獻[9-12]設計，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。參考引物序列如表1所示。

1.2.2.3 目的基因 PCR擴增反應 ①PCR反應體系：DNA樣本 17 μl，上游引物2 μl，下游引物2 μl，Golden DNA polymerase 4 μl，2×Reaction Mix 21 μl，ddH2O 4 μl，進行PCR反應。各目的基因擴增程序見表2。②PCR擴增程序。

1.2.2.4 瓊脂糖凝膠電泳成像確定擴增基因片段長度 取制好的瓊脂糖凝膠浸入電泳液(0.5×TBE)中，以DNA Marker作為片段分子量的標記，依次將各目的基因PCR擴增產物6 μl及Marker6 μl加入2%瓊脂糖凝膠中，調節電泳電壓100V，進行電泳實驗。電泳實驗完成后將瓊脂糖凝膠放置于電泳成像儀中，觀察各個細胞因子基因的擴增片段長度(如圖1)。

表1 各細胞因子的引物序列

Tab.1 Primer sequences of cytokine genes

CytokinegenePrimersequenceSNPTNF?αF：5′?AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT?3′R：5′?TCCTCCCTGCTCCGATTCCG?3′SNP?308IL?6F：5′?TGACTTCAGCTTTACTCTTGT?3′R：5′?CTGATTGGAAACCTTATTAAG?3′SNP?174IL?10F：5′?CTCGCTGCAACCCAACTGGC?3′R：5′?TCTTACCTATCCCTACTTCC?3′SNP?1082TGF?β1F：5′?ATCTAGGTTATTTCCGTGGGATA?3′R：：5′?TTGTGGGTTTCCACCATTAGCA?3′SNP+869，SNP+915IFN?γF：5′?ATCCAAGACAACACTACTAAG?3′R：5′?TTGAGACTCTAATATTGAGAC?3′SNP+874

表2 各細胞因子基因PCR反應條件

Tab.2 PCR reaction conditions of cytokine genes

CytokinegenePre?denaturationDenaturationAnneallingExtensionCyclesFinalextensionTNF?α94℃，3min94℃，30s60℃，15s72℃，1min3072℃，5minIL?695℃，4min95℃，1min57℃，1min72℃，1min3072℃，5minIL?1095℃，3min94℃，30s58℃，1min72℃，1min3072℃，10minTGF?β194℃，3min94℃，30s60℃，1min72℃，1min3072℃，7minIFN?γ94℃，3min94℃，30s58℃，30s72℃，1min3072℃，5min

圖1 各個目的基因PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Map of agarose gel electrophoresis of polymerase chain reaction amplified products for multiple target genesNote:M.pBR322 DNA/Mspl Marker. Fig.A:1.TNF-α-308 GG genotype;2.TNF-α-308AG genotype. Fig.B:1.IL-6-174 GG genotype;2.IL-6-174 GG genotype. Fig.C:1.IL-10-1082 AA genotype;2.IL-10-1082 AG genotype. Fig.D:1.TGF-β1+869 CC genotype;2.TGF-β1+869 TC genotype;1,2.TGF-β1+915 GG genotype. Fig.E:1,2.IFN-γ+874 TT genotype;3,4.IFN-γ+874 TA genotype.

圖2 各個細胞因子目的基因PCR產物測序圖譜Fig.2 Sequencing map of polymerase chain reaction amplified products for multiple target genesNote:The site which arrow indicates is the mutation site of the target gene.

1.2.2.5 聚合酶鏈反應產物基因測序檢測目的基因特殊位點基因多態性變化 將PCR產物標本送英濰捷基(上海)貿易有限公司進行測序分析。根據測序結果，與各目的基因SNP位點進行比對后確定基因分型(如圖2)。

2 結果

2.1 各細胞因子目的基因PCR擴增結果 通過瓊脂糖凝膠電泳后對目的片段進行比對后發現，擴增產物DNA片段長度與Genbank中目的基因在引物擴增后得到的預期片段長度相一致。

2.2 細胞因子基因多態性位點測序圖譜 通過將目的基因擴增產物進行基因測序后發現，能夠對不同細胞因子基因特殊SNP位點的基因分型進行有效的區分和鑒別。

2.3 allo-HSCT患者組與正常對照組的基本資料及各細胞因子基因型分布頻率比較 患者組女性10例，男性22例，平均年齡(48.3±12.7)歲；對照組女性13例，男性23例，平均年齡(51.6±14.2)歲。患者組和對照組在性別及年齡構成上未表現出統計學意義。實驗結果顯示，TNF-α-308、IL-6-174、IL-10-1082、TGF-β+869、TGF-β+915、IFN-γ+874各細胞因子特殊SNP位點上的基因型分布情況在allo-HSCT患者組和正常對照組中無顯著性差異(如表3)。通過將目的基因擴增產物進行基因測序后發現，能夠對不同細胞因子基因特殊SNP位點的基因分型進行有效的區分和鑒別(如圖2)。

2.4 細胞因子基因多態性與allo-HSCT患者出現aGVHD的嚴重程度及發病率的相關性

2.4.1 TNF-α-308(G/A)基因多態性對allo-HSCT患者移植療效的影響 從PCR結合基因測序結果分析，在32例allo-HSCT患者組中針對TNF-α-308SNP位點共檢測出G/G及A/G兩種基因型。其中25例G/G型allo-HSCT患者有3例(12%)出現重度aGVHD，7例A/G型allo-HSCT患者中有1例(14.29%)出現aGVHD，P>0.05(P=0.97)(見表4)。提示兩種基因型患者中嚴重aGVHD的發生率無顯著性差異。TNF-α-308(G/A)基因多態性對allo-HSCT患者重度aGVHD的發生情況無顯著影響。

2.4.2 IL-6-174(G/C)基因多態性對allo-HSCT患者移植療效的影響 在32例allo-HSCT患者組中針對IL-6 -174SNP位點進行測定，未發現C/C、C/G基因型，32例患者全部為G/G基因型，4例出現重度aGVHD(見表4)。患者組與正常對照組的基因分型無顯著差異，無進行基因多態性比較的意義。

2.4.3 IL-10-1082(G/A)基因多態性對allo-HSCT患者移植療效的影響 在allo-HSCT患者組中針對IL-10-1082SNP位點檢測出A/A及A/G兩種基因型，未發現1082G/G基因型。其中在29例為A/A基因型患者中有4例出現重度aGVHD(見表4)。

表3 allo-HSCT組和對照組中疾病相關細胞因子基因型的頻率分布

Tab.3 Distribution of disease related cytokines genotype in allo-HSCT and control group

CytokinegeneSNPgroupallo?HSCTgroup(n=32)Normalcontrolgroup(n=36)χ2PTNF?α?308G/G25(7812%)30(8333%)02970759A/A00A/G7(2188%)6(1667%)IL?6?174G/G32(100%)36(100%)——C/C00G/C00IL?10?1082A/A29(9063%)31(8611%)03330713A/G3(937%)5(1389%)G/G00TGF?β+869C/C16(50%)22(6111%)15880452T/T9(2813%)10(2778%)C/T7(2187%)4(1111%)TGF?β+915G/G31(9687%)35(9722%)00071000C/C00G/C1(313%)1(278%)IFN?γ+874T/T17(5313%)12(8056%)27130141A/A00T/A15(4687%)24(1944%)

表4 細胞因子基因分型在allo-HSCT患者的分布情況及不同基因型中重度aGVHD的發生率

Tab.4 Distribution of multiple target cytokines genotype in allo-HSCT patients and incidence of severe aGVHD in different genotypes

CytokinesgenesSNPgroupsnMild(0-Ⅰ)Severe(Ⅱ-Ⅳ)RateofsevereaGVHDinspecialgenotype/%PTNF?α?308(n=32)G/G2522312(3/25)A/A0000097A/G7611429(1/7)IL?6?174(n=32)G/G32284125(4/32)—C/C0000G/C0000IL?10?1082(n=32)A/A29254125(4/32)—A/G3300G/G0000TGF?β1+869(n=32)C/C1616000001(C/CvsC/T)T/T99000009(T/TvsC/T)C/T7345714(4/7)TGF?β+915(n=32)G/G31274129(4/31)07C/C0000G/C1100IFN?γ+874(n=32)T/T171421176(2/17)0893A/A0000T/A151321333(2/15)

而在36例正常人群中，IL-10-1082SNP位點同樣未檢測出G/G基因型，并且患者組與正常對照組的基因型分布無差異，未對該基因型進行分析。

2.4.4 TGF-β1+869(C/T)基因多態性對allo-HSCT患者移植療效的影響 針對TGF-β1+869基因多態性與aGVHD發病的相關性進行分析后發現，對全部allo-HSCT患者針對TGF-β1+869SNP位點共檢測出C/C、T/T及C/T三種基因型。其中有7例為C/T型患者，4例出現重度aGVHD，發生率為57.14%。明顯高于TT型患者(P<0.01)(P=0.009)及CC型患者(P<0.01)(P=0.001)(CC型患者16例，TT型患者9例，均無嚴重aGVHD出現),見表4。患者組與對照組相比，基因型分布趨于一致，allo-HSCT患者易感性無關。結果提示TGF-β1+869C/T基因型是allo-HSCT患者誘發重度aGVHD起病的危險因素。

2.4.5 TGF-β+915(G/C)基因多態性對allo-HSCT患者移植療效的影響 對全部32例allo-HSCT患者針對TGF-β+915SNP位點共檢測出G/G、G/C兩種基因型。其中有31例為G/G型患者，4例出現重度aGVHD，發生率為12.9%(4/31)。1例為G/C型患者，無aGVHD發生，P>0.05(P=0.7)(見表4)。患者組與對照組的基因型分布無統計學意義。TGF-β+915(G/C)基因多態性對allo-HSCT患者aGVHD的發生情況無顯著影響。

2.4.6 IFN-γ+874(T/A)基因多態性對allo-HSCT患者移植療效的影響 在全部allo-HSCT患者組中針對IFN-γ+874(T/A)SNP位點檢測出T/T及T/A兩種基因型。其中17例T/T型allo-HSCT患者有2例(11.76%)出現aGVHD，15例T/A型allo-HSCT患者中有2例(13.33%)出現嚴重aGVHD，P>0.05(P=0.893)(見表4)。結果表明IFN-γ+874(T/A)基因多態性對allo-HSCT患者aGVHD發生的嚴重程度沒有顯著影響。

3 討論

異基因造血干細胞移植是目前治愈多種血液系統惡性疾病和遺傳性疾病的唯一手段。而移植相關并發癥則是影響造血干細胞移植進一步發展的主要障礙，其中急性移植物抗宿主病(aGVHD)作為一組累及皮膚、肝臟和腸道的臨床病例綜合征，是導致移植相關患者死亡最主要的原因。人類編碼細胞因子的基因位于染色體的不同部位上，DNA序列區中的特殊SNP位點存在著對應的堿基變化。編碼區域內的核苷酸序列差異，引起密碼子的改變，致使蛋白質上氨基酸不同，細胞因子分泌的水平高低不一，導致不同個體間的藥物代謝和生物利用度出現差異。“細胞因子風暴”被認為貫穿于該疾病的發病過程，盡管aGVHD發病的確切分子機制尚不清楚，但細胞因子分泌失調被認為是aGVHD發病的病理生理基礎。越來越多的研究表明，疾病相關細胞因子基因多態性在aGVHD的易感性及發病嚴重程度等方面扮演了至關重要的角色[13]。

本組研究采用PCR聯合基因測序的手段對32例行allo-HSCT受者多種疾病相關因子基因多態性進行測定結合臨床療效分析后發現，在采用相同預處理方案及預防GVHD方案條件下，TNF-α-308(G/A)、IL-6-174(G/C)、IL-10-1082(G/A)、TGF-β+915(G/C)、IFN-γ+874(T/A)等多種細胞因子的基因多態性與嚴重aGVHD的發生率之間未見有顯著性的差異。但在TGF-β1+869SNP位點上，C/T型allo-HSCT患者中重度aGVHD的發病率遠高于C/C、T/T兩個基因型患者組；且在患者及正常人群中，TGF-β1+869各基因型的分布比率趨于一致。本文的實驗結果提示TGF-β1+869 C/T雜合子基因型allo-HSCT患者在采用相同GVHD預防用藥方案下較純合子型更容易在術后發生嚴重aGVHD，與aGVHD發病的分子機制具有潛在聯系。

TGF-β1作為生命體內重要的功能調節因子，對細胞增殖、分化具有重要調控作用，對機體的免疫系統具有廣泛影響，被認為在心臟、腎臟及肝臟等器官的排斥反應中扮演重要角色[14，15]。相關文獻指出，TGF-β1對細胞增殖具有雙向調節功能，對不同靶細胞及不同功能條件下相同靶細胞產生不同作用效果，與其在特殊SNP位點的基因分型有關[16]。TGF-β1基因多態性可能在aGVHD發病的分子機制中發揮了關鍵性的調控作用。研究表明，CsA能夠促進TGF-β1mRNA的表達，在體內及體外均能夠引起TGF-β1水平升高[17]。TGF-β1+869基因多態性可能引起不同患者在相同CsA劑量下表現出不同的藥物敏感性，是誘發重度aGVHD起病的潛在危險因素之一，針對不同病人合理調整免疫抑制用藥可能是預防移植術后急性排斥反應發生的重要手段。基于藥物基因組學的個體化治療根據每個病人的遺傳結構實行分子診斷，選擇合適的藥物和劑量，優化治療方案，是個體化醫學的先行領域。通過對allo-HSCT受者疾病相關基因在特殊位點的基因分型進行檢測，可能對移植術后受者所出現的免疫排斥反應的嚴重情況進行有效的評估，從而預測移植受者對移植物的免疫應答狀態，有助于建立更加合理的制定用藥方案，指導免疫抑制藥物種類和劑量的調整，避免不良反應的發生。

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[收稿2016-05-27 修回2016-06-14]

(編輯 許四平)

Correlation between cytokine gene polymorphism and aGVHD in allo-HSCTrecipients

JIN Xue-Feng,YE Dong-Mei,LAN Mei,CHEN Ying.

The People′s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region,Nanning 530021,China

Objective:To investigate the relationship between gene polymorphisms of disease-relevant multiple cytokines including TNF-α,IL-6,IL-10,TGF-β1,IFN-γ and acute graft versus host disease(aGVHD) in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation(allo-HSCT).Methods:32 cases of recipients received allo-HSCT and 36 cases of normal groups in January 2014 to December 2015 were selected as objects of study.We detected genotypes on specific SNP of target genes by polymerase chain reation(PCR) combined with gene sequencing and observed the occurrence of aGVHD in postoperative recipients.The influence of cytokine gene polymorphisms on prognosis of allo-HSCT patients was analyzed,and the potential relationship between specific SNP mutation of the disease-relevant cytokine genes and severity of aGVHD was discussed.Results:Distribution of cytokines gene polymorphism including TNF-α-308(G/A),IL-6-174(G/C),IL-10-1082(A/G),TGF-β1+915(G/C),IFN-γ(T/A) had no significant differences with incidence of severe aGVHD(P>0.05).However,the occurrence of severe aGVHD in allo-HSCT recipients with C/T genotype was significantly higher than C/C and T/T in SNP of TGF-β1+869(P<0.01).Conclusion:Gene polymorphism of TGF-β1+869(C/T) in allo-HSCT patients was closely related to the occurrence of severe aGVHD.The research show allo-HSCT patients with C/T genotype occurred severe aGVHD more frequently,which is an important potential risk factor to induce the incidence of severe aGVHD.Therefore,detecting gene polymorphism of TGF-β1+869(C/T) in allo-HSCT recipients and developing the appropriate therapeutic regimen may be helpful to reduce the incidence of aGVHD.

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation(allo-HSCT)；Cytokine gene；Polymorphism;Acute graft versus host disease(aGVHD)；Individual administration

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.021

金雪峰(1987年-)，男，醫學碩士，主要從事基礎藥理學及臨床合理用藥等方面研究，E-mail:jinxuefeng_521111@126.com。

及指導教師：藍 梅(1974年-)，女，醫學碩士，副主任醫師，主要從事血液系統及風濕免疫疾病診療方面的研究，E-mail:meilanmo@sina.com。

R394.3

A

1000-484X(2016)12-1820-06

①本文為廣西醫療衛生適宜技術研究與開發項目(No.桂衛S201420-01)。