點免疫金滲濾法篩選膠體金標記抗人IgG的研究①

房彬彬 齊新偉 王 黎 馮曉輝

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究院,烏魯木齊830054)

點免疫金滲濾法篩選膠體金標記抗人IgG的研究①

房彬彬 齊新偉②王 黎 馮曉輝

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究院,烏魯木齊830054)

目的：應用點免疫金滲濾法篩選適宜膠體金標記的抗人IgG(以下簡稱二抗)，并運用多個評價指標進行比較和分析。方法：選擇三個不同公司的二抗用膠體金標記，根據(jù)棋盤滴定法確定最佳標記條件；運用點免疫金滲濾法對三種二抗的膠體金標記后檢測效能進行比較，采用包蟲病人和健康對照血清，用包蟲病特異性抗原檢測包蟲病患者血清中的特異性抗體，評價最優(yōu)的二抗，并與酶聯(lián)免疫吸附測定法進行比較。結果：A、B、C三種二抗標記的最佳標記條件為：pH均為8.5，加入量分別為38.4、24、19.2 μg/ml，綜合評價二抗B檢測效能最優(yōu)。將其與酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測效能進行比較，兩種方法檢測結果的Kappa=0.895(P<0.05)，吻合度較強。結論：應用點免疫金滲濾法，以及本文提出的評價指標，能夠篩選出最佳二抗，對檢測試劑盒中二抗的選擇具有重要的參考價值。

包蟲病；篩選；膠體金標記；抗人IgG

膠體金作為快速簡便的示蹤劑，近年來在疾病的快速檢測和床邊檢測顯示出其優(yōu)勢，尤其是在臨床免疫學檢測中，如早早孕試紙條、艾滋病快速檢測卡等。我單位研制并成功注冊的包蟲病特異性抗體檢測試劑盒(膠體金法)，就是以膠體金標記的抗人IgG作為二抗，采用點免疫金滲濾法(Dot immunogo-ld filtration assay,DIGFA)檢測針對4種不同抗原的包蟲病患者血清中特異性抗體[1，2]。

目前膠體金標記抗體的方法已有研究報道[3，4]，但大部分都是以特定抗體進行膠體金標記條件的篩選。然而，近年來國內外抗體種類及品牌不斷增加，對于如何篩選合適的抗體進行標記，用于檢測試劑盒研制的研究較少。本試驗選擇了三個國內外不同公司的二抗，運用多個指標對其進行綜合評價，最終篩選出適用于包蟲病特異性抗體檢測試劑盒的最佳二抗。該篩選模式提出了篩選抗體時的評價指標，為其他檢測試劑盒中膠體金標記二抗的選擇提供了重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 三種二抗標記后檢測效能比較時，選取新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院經(jīng)手術確診的20例包蟲病患者血清(15例囊型包蟲病，5例泡型包蟲病)作為標準陽性樣本；健康人血清20例作為標準陰性樣本。DIGFA和酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測效能比較時，選取新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院經(jīng)手術確診的90例包蟲病患者血清(71例囊型包蟲病，19例泡型包蟲病)作為標準陽性樣本；健康人血清122例作為標準陰性樣本。以上樣本均由新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院標本庫提供。

1.1.2 試劑和儀器 DIGFA反應板由新疆貝斯明生物技術發(fā)展有限公司提供；膠體金及主要檢測用包蟲病抗原(頭節(jié)抗原、粗囊液抗原)均為實驗室自制[5]；HRP標記的羊抗人IgG、明膠購自美國Sigma公司；待標記二抗購自國內外三個廠家，以A、B、C表示；其他試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。酶標儀為Bio-Rad公司xMark全波長酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 二抗的膠體金標記方法 取膠體金5 ml，用四硼酸鈉調pH至最佳，分別加入三種二抗的最佳加入量，混勻，放置4℃充分反應50 min，加入適量含有聚乙二醇、明膠和飽和蔗糖溶液的Tris-HCl進行封閉，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 二抗標記條件篩選 由1.2.1可知，影響膠體金標記二抗的主要因素有pH值，標記時二抗加入量。根據(jù)棋盤滴定法以及膠體金遇鹽沉淀的特性，設計不同二抗的用量和pH的梯度實驗，觀察顯色情況，即可得出理論二抗加入量，最佳二抗加入量為理論二抗加入量的120%，同時相應的pH值/四硼酸鈉加入量則為最佳pH值/四硼酸鈉加入量。

1.2.3 三種二抗標記后檢測效能比較 效能檢測采用DIGFA檢測標準陽性樣本和標準陰性樣本各20份來評價。先將頭節(jié)抗原、粗囊液抗原溶液分別點樣包被于反應板硝酸纖維素膜孔內不同位置，37℃干燥備用；相應的樣品稀釋液及洗滌液的 pH值調節(jié)至二抗標記時的最佳pH。待測血清1∶10稀釋，加100 μl至包被好的反應板上，待其滲濾完全，洗滌液洗滌后，分別加入3種膠體金標記的二抗溶液，再次洗滌，觀察顯色結果，兩種抗原任意一種抗原陽性即視為包蟲病抗體陽性。分別計算三種標記二抗在DIGFA實驗中的敏感性、特異性、符合率、精密度和最低檢出限[6，7]，評價各自的檢測效能。其中精密度及最低檢出限參照新疆貝斯明生物技術發(fā)展有限公司包蟲病特異性抗體檢測試劑盒(膠體金法)產(chǎn)品標準進行檢測及計算。

1.2.4 DIGFA和ELISA檢測效能的比較 選取1.2.3標記效能最優(yōu)的抗體，與ELISA檢測包蟲病特異性抗體進行比較。分別包被兩種抗原于酶標板上，4℃過夜，封閉后，待測樣本按照1∶100稀釋，進行常規(guī)間接ELISA檢測包蟲病特異性抗體，450 nm吸光度值測定。結果判讀根據(jù)各抗原的CUT OFF值判定為陽性或陰性，以兩種抗原任意一種抗原陽性即視為包蟲病抗體陽性，比較DIGFA與ELISA方法的陽性符合率、陰性符合率和總符合率[8,9]。

1.3 統(tǒng)計學方法 本研究所有數(shù)據(jù)均使用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件處理分析，應用多個獨立樣本率的χ2檢驗，比較三種二抗標記后的檢測效能，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義；應用Kappa檢驗比較兩種檢測方法結果的吻合度，Kappa≥0.7，表示吻合度較強；0.7>Kappa≥0.4，表示吻合度一般；Kappa<0.4，表示吻合度較弱，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 二抗標記條件篩選 pH梯度是以不同量的四硼酸鈉與1 ml膠體金溶液混合來創(chuàng)建的，四硼酸鈉加入量梯度為20、40、60、80、100、120、140、160 μl，由此產(chǎn)生的pH值范圍約從6.0到9.0。三種二抗稀釋液的初始濃度均為1 mg/ml，二抗加入量梯度為1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6 μl。運用酶標板，A-H行加入不同pH梯度的膠體金溶液100 μl,則 A行具有最低pH值，H行有最高pH值。1～7列加入不同梯度二抗加入量，1列具有最低二抗加入量，7列具有最高二抗加入量。靜置10 min，每孔加入100 μl氯化鈉。觀察顯色反應，膠體金與二抗結合成功，則溶液保持紅色,二抗量不足以穩(wěn)定膠體金的則呈現(xiàn)由紅變藍的聚沉現(xiàn)象。選取溶液保持紅色，二抗及四硼酸鈉用量最少者為最佳。通過棋盤滴定法，得到A、B、C三種抗體標記時的最佳四硼酸鈉加入量均為100 μl，即pH=8.5，理論二抗加入量為32、20和16 μg/ml，最佳二抗加入量分別為38.4、24和19.2 μg/ml。

表1 三種二抗標記后檢測效能比較

Tab.1 Comparison of diagnostic effects with three kinds of IgG

DetectionitemsSecondaryantibodyABCχ2PSensitivity95%(19/20)100%(20/20)95%(19/20)10170601Specificity90%(18/20)90%(18/20)70%(14/20)37760151Consistencerate925(37/40)95(38/40)825(33/40)38560145Minimumdetectability1∶321∶641∶16--

表2 DIGFA和ELISA檢測效能的比較

Tab.2 Comparison of diagnostic effect by DIGFA and ELISA

DIGFAELISA+-Total+871097-1114115Total88124212Kappa0895P0000

2.2 三種二抗標記后檢測效能比較 運用標準陽性樣本20份和標準陰性樣本20份，對三種膠體金標記的二抗平行檢測，并計算敏感性、特異性、符合率、精密度和最低檢出限，敏感性方面，B的敏感性最好，達到100%；特異性方面，A與B的特異性為90%；符合率方面，B符合率最高，為95%；精密度方面，三種二抗均為100%；最低檢出限方面，B優(yōu)于A和C；三種二抗敏感性、特異性和符合率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。綜上所述，二抗B綜合評價最優(yōu)，故選擇該抗體為適用于包蟲病特異性抗體檢測試劑盒的最佳抗體。結果見表1。

2.3 DIGFA和ELISA檢測效能的比較 通過對DIGFA和ELISA兩種方法檢測包蟲病特異性抗體，檢測結果顯示：陽性符合率為98.86%；陰性符合率為91.94%；總符合率為94.81%；兩種方法吻合度評價采用Kappa檢驗，Kappa=0.895>0.7，吻合度較強，Kappa 系數(shù)檢驗，P=0.000，兩種方法的吻合度有統(tǒng)計學意義。結果見表2。

3 討論

免疫膠體金技術是繼免疫酶標技術、免疫熒光技術和放射免疫技術之后的第四大免疫標記技術[10]，目前已基本成熟并得到廣泛應用，作為一種免疫檢測技術與其他方法相比，在許多方面都具有無可比擬的優(yōu)勢。多項研究表明,膠體金法在檢測多種疾病時具有較好的診斷價值，且與ELISA比較時，具有較好的一致性[11,12]，而且操作簡便、快速，無需特殊儀器設備，可單份檢測，適合基層各種疾病的臨床檢驗和疾病流行區(qū)的現(xiàn)場流行病學調查。所以，篩選出合適的二抗進行膠體金標記，能夠在各種疾病的早期診斷和初步篩查中發(fā)揮重要的作用。

本文中所選取的樣本為手術確診的囊型包蟲病患者血清以及泡型包蟲病患者血清，故陽性率較高，若在其他實驗中，樣本為非手術確診樣本，則應相應降低篩選要求，且本文旨在提供篩選標記二抗的方法，未對大量樣本進行檢測及相應的效能比較，若為研制試劑盒進行膠體金標記二抗的篩選時，則需增大樣本量，以獲得更為可靠的數(shù)據(jù)。

膠體金標記后檢測效能比較時，敏感性、特異性、符合率差異雖無統(tǒng)計學意義，但在實際試劑盒成品質檢過程中，此類試劑盒合格與否的判定標準為：10份標準陽性血清中不得超過1份假陰性，20份標準陰性血清中不得超過2份假陽性，故二抗C的特異性不符合要求，已可排除。二抗B因其最低檢出限最優(yōu)，而選擇為適用于包蟲病特異性抗體檢測試劑盒的最佳二抗。

本文的比較方法以及評價指標暫無相關文獻報道，填補了膠體金標記的最佳二抗篩選模式的空缺，促進了醫(yī)學基礎研究向臨床應用的轉化，為更多科學研究轉化的臨床檢測、診斷手段奠定了基礎。

[1] Feng XH,Wen H,Zhang Z,etal.Dot immunogold filtration assay (DIGFA) with multiple native antigens for rapid serodiagnosis of human cystic and alveolar echinococcosis[J].Act Trop,2010,113(2):114-120.

[2] Zhang WB,Wen H,Li J,etal.Immunology and immunodiagnosis of cystic echinococcosis:an update[J].Clin Dev Immunol,2012:101895.

[3] 宋宏新,鄒聯(lián)柱,李 韻,等.納米膠體金的制備及其抗體標記研究[J].食品科技,2011,36(3):249-252.

[4] 劉珊娜,葛懷娜,孟繁桐,等.李斯特菌免疫檢測用膠體金的制備及抗體標記[J].食品科技,2016,41(1):321-324.

[5] 溫 浩.包蟲病學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2015:34-35.

[6] 梁啟忠,程玉根,唐建祥,等.5種梅毒酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑性能比較[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,2012,33(2):227,241.

[7] 張志慧,危艷武,吳洪麗,等.豬圓環(huán)病毒2型幾種ELISA抗體檢測試劑盒的比較與應用[J].中國預防獸醫(yī)學報,2014,36(2):129-133.

[8] 劉忠華,許 松.膠體金法與ELISA法檢測抗CCP抗體用于診斷RA的比較研究[J].中外醫(yī)療,2015,34(28):25-27.

[9] 高 麗,付 鴻,李 慧,等.膠體金試紙法與酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測乙型肝炎病毒表面抗原的比較[J].中國計劃免疫,2007,13(1):51-53.

[10] Ngom B,Guo Y,Wang X,etal.Development and application of lateral flow test striptechnology for detection of infectious agents and chemical contaminants:a review[J].Anal Bioanal Chem,2010,397(3):1113-1135.

[11] 謝秋南.對比分析酶聯(lián)免疫法和膠體金法檢測病毒性丙型肝炎的效果[J].吉林醫(yī)學,2015,36(2):277.

[12] 歐仕穎,余長芳.用DIGFA,ELISA兩種免疫診斷方法檢測包蟲病的綜合評價[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志,2011,26(5):121-123.

[收稿2016-09-08 修回2016-10-09]

(編輯 許四平)

Screening anti-human IgG for colloidal gold conjugate with dot immunogold filtration assay

FANG Bin-Bin,QI Xin-Wei,WANG Li,FENG Xiao-Hui.

Clinical Medical Research Institute of the First Affiliated Hospital,Xinjiang Medical University,Urumqi 830054，China

Objective:To screen the appropriate anti-human IgG (secondary antibody) for conjugating with colloidal gold by dot immunogold filtration assay,and put forward the method of using multiple evaluation indicators for secondary antibody comparing and analyzing.Methods:Three different secondary antibodies A,B and C from three different companies were screened.Firstly the titration was used to determine the optimal reaction conditions.Then three secondary antibodies were conjugated to the colloidal gold,tested with a dot immunogold filtration assay for hydatidosis specific antibody detection.The optimal conjugated secondary antibody were compared with the standard indirect enzyme-linked immunosorbent assay.Results:The optimal pH of three secondary antibodies were 8.5,the binding capacity were 38.4,24 and 19.2 μg /ml colloidal gold.According to the comprehensive evaluation,the diagnostic effects of secondary antibody B was better than others.Its diagnostic effects in dot immunogold filtration assay was compared with enzyme-linked immunosorbent assay.The Kappa was 0.895(P<0.05) and showed the two methods were in good agreement.Conclusion:The appropriate secondary antibody for conjugating with colloidal gold could be screened by dot immunogold filtration assay and the evaluation indicators which put forward by this study,the screening method would have an important reference value for all kinds of colloidal gold test kit to screen the suitable secondary antibody.

Hydatidosis;Screen;Colloidal gold conjugate;Anti-human IgG

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.014

房彬彬(1989年-)，女，助理實驗師，主要從事寄生蟲病免疫學標志物研究，E-mail:xj_binbin5515@sina.com。

及指導教師：馮曉輝(1971年-)，女，博士，研究員，主要從事寄生蟲病免疫學標志物研究，E-mail：feng_xh_cn@aliyun.com。

R446.61

A

1000-484X(2016)12-1790-04

①本文為新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院科研獎勵基金(2011YFY16)。

②并列第一作者。