基因測序技術在腫瘤診療中的應用進展

劉加強，彭旭東，劉德軍

(中央軍委聯合參謀部警衛局保健處，北京 100017)

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·綜述·

基因測序技術在腫瘤診療中的應用進展

劉加強，彭旭東，劉德軍

(中央軍委聯合參謀部警衛局保健處，北京 100017)

腫瘤是當今導致人類主要死亡的主要疾病之一。由于其發病隱匿、治療方法局限、多數預后不良，且分子生物學特征復雜多變，因而腫瘤的預防、早期篩查與診斷、個體化治療、預后評估一直是臨床醫生致力于解決的關鍵問題。研究已證實，腫瘤多存在基因的改變，隨著分子生物學技術的發展，基因測序技術取得長足進步，這對上述難題的解決起到巨大的推動作用[1-4]。本文就基因測序技術在腫瘤診療中的應用進行綜述。

1 基因測序技術的概述

第一代基因測序技術出現于20世紀70年代，標志性技術是由Sanger和Gilbert等人發明的鏈終止法和化學降解法，已廣泛應用于生命科學研究中，如人類基因組計劃即是采用第一代測序技術，總共測量了人類基因組中約30億個堿基對，發現大量與疾病有關的基因，為疾病的診斷與治療提供了大量信息[5-7]。第一代基因測序技術方法簡便快捷，但測序通量低，操作過程復雜且費用高，在大樣本測序上也存在諸多困難。

第二代基因測序技術又稱高通量或深度測序技術，其典型代表包括454測序技術、Illumina測序技術和SOLID測序技術[8]。第二代測序技術最大的優勢就是高通量，可進行基因組、轉錄組和表觀遺傳學方面的檢測。第二代基因測序技術成本低，費用只相當于第一代的1%，從而推動了基因測序技術的普及。如今，第二代測序技術已成為應用最為廣泛的測序技術，首張癌癥基因組圖譜(TCGA)、千種單基因病研究計劃等陸續啟動，為生物醫學的發展起到巨大的推動作用。但由于其讀長偏短(100～500 bp)且制備測序樣本時需要經過PCR擴增，而這一過程可能引起突變而影響準確性[9]。

第三代基因測序技術以單分子實時測序(SMRT)和納米孔技術為標志。其中，單分子實時測序技術采用熒光標記脫氧核苷酸，通過顯微鏡動態觀察DNA合成時熒光強度的變化而檢測堿基序列[10-11]；納米孔技術利用電泳技術驅動單個分子逐一通過納米孔而實現測序[12-13]。第三代基因測序技術具有高通量、長度長(達14 000 bp)、樣本不需要PCR擴增、可以檢測極細微的差異以及小型化的優點，但其出錯率較高，需要重復多次檢測才能保證較高的準確率[14]。隨著技術的進步，上述問題有望早日得到解決，從而達到一人一個基因組乃至多個基因組的目標。

2 基因測序技術在腫瘤診療中的應用

2.1 腫瘤篩查與診斷 盡管近年來基因測序技術發展迅速，但其在腫瘤的篩查與診斷方面的臨床應用仍十分有限[15]。目前，腫瘤的篩查主要以腫瘤標記物檢測、體格檢查以及常用的影像學檢查為主，而腫瘤診斷的金標準為病理學診斷。隨著技術的不斷進步和檢測成本的持續降低，基因測序技術常規應用于腫瘤篩查和診斷將為腫瘤的預防和早期治療提供幫助。通過檢測個體DNA序列可以發現基因組的異常變異，從而可以評估腫瘤疾患的風險。美國23andMe公司于2007年即開始向大眾提供基因檢測服務，內容包括始祖分析、基因尋親、酒精耐受、藥物過敏、遺傳病篩查和疾病風險評估。通過基因組測序篩查癌癥等疾病開始被美國民眾(包括部分名人)所采用。但由于數據解讀的準確性以及倫理爭議，FDA于2013年叫停了與健康有關的數據解讀服務，但于2015年又重新批準23andMe公司開展遺傳病的基因檢測，如布魯姆綜合征(一種可能導致身材矮小并癌癥高發的疾病)。目前，國內個別醫療機構也開始進行基因測序篩查癌癥的臨床試點工作，采用的技術為循環游離腫瘤DNA測序技術。

循環游離腫瘤DNA(ctDNA)測序技術是液體活檢的一種，與現有的組織活檢技術不同，其通過檢測外周血或體液標本中ctDNA可以在疾病早期檢出腫瘤[16]。早在1998年就有研究證實了利用ctDNA診斷癌癥的可行性。在結腸癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌和頭頸部癌等癌癥中，ctDNA中包含DNA點突變、甲基化、微衛星不穩定性等諸多變異信息[17]。但由于傳統檢測方法的局限性，只能針對某一個或幾個特定的基因進行檢測，從而限制了其在癌癥診斷領域的應用。高通量測序技術的發展使得研究者能夠對ctDNA進行全基因組測序[18]。Dawson等[19]證實采用基因測序技術檢測ctDNA在監測腫瘤負荷的敏感性和動態性方面均優于傳統的腫瘤標記物檢測和循環腫瘤細胞檢測。該研究提示利用基因測序技術檢測ctDNA有望成為腫瘤患者早期診斷的有力手段。

2.2 腫瘤個體化治療 個體化治療一直是腫瘤治療過程中的熱點問題，高通量基因測序技術的出現推動了腫瘤個體化治療的進展。部分腫瘤患者基因組存在特征性的改變，如甲基化水平的改變，KRAS、EGFR、TP53、BRCA1、BRCA2基因突變等[20]。通過高通量測序技術可以精確檢測出這些變異，從而幫助制訂個體化的治療措施，包括分子靶向藥物或通路靶向藥物的使用和放化療的應用[21]。同時，采用高通量測序技術比較腫瘤原發灶與復發灶基因序列的差異，可以幫助評估化療效果和了解耐藥的潛在機制[22]。既往腫瘤患者的基因測序取材手段主要為組織活檢，但該方式的有創性會影響對基因狀況的實時觀察，同時由于腫瘤存在異質性，單一部位的活檢并不能反映腫瘤的全貌；采用高通量測序技術無創性檢測ctDNA將會很好地解決上述問題[16,23]。Uchida[24]和Sober等[25]證實對肺癌患者ctDNA進行深度測序可確定其表皮生長因子受體(EGFR)分型，從而決定是否使用酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)進行靶向治療。Liao等[26]采用高通量測序技術檢測肝癌患者ctDNA，證實其可預測無復發生存期，并可克服腫瘤異質性的限制。通過高通量測序技術監測編碼免疫球蛋白受體的ctDNA片段可比影像學檢查更早發現彌漫性B淋巴瘤的復發，同時還可提供腫瘤異質性、克隆演變進程和耐藥機制方面的信息，從而指導淋巴瘤的個體化治療[27]。由于基因測序技術在取材手段和方式方法的不斷更新，其必將在腫瘤個體化治療中發揮舉足輕重的作用，從而開啟精準醫療的新篇章。

3 存在的問題及展望

雖然基因測序技術可以幫助人類了解更多腫瘤相關的基因信息，從而推動腫瘤篩查、診斷與治療的發展，但由于疾病與基因并非嚴格對應的關系，其可能還會受到環境因素等的影響，故單純通過基因測序的方法檢測基因變異來預測和診斷腫瘤有一定局限性。同時，由于腫瘤單分子靶向治療的耐藥性，故還需要通過基因測序技術深入了解腫瘤分子生物學特征，從而尋找更多有效的靶點，采取聯合治療的策略[28]。隨著基因測序技術成本的降低，基因測序技術必將普遍應用于大眾，但由此可能會引起的個人基因組信息的泄露，從而導致保險、就業歧視等一系列社會問題，尚需制訂和完善相關法律法規來規范其應用。由于測序結果所包含信息的復雜性與海量性，如何正確地向受試者解讀這些數據，避免引起其不必要的擔憂也尤為重要[29]。目前使用的基因測序技術仍以高通量基因測序技術為主導，但多數第二代測序平臺具有讀長短的缺陷，從而影響到基因重復序列和插入缺失檢測的準確性。第三代測序技術雖然有望解決這一問題，但其仍處于研發階段，距大規模應用還有較長的時間。同時，基因測序技術越來越高通量的發展趨勢也對計算機數據處理能力提出了更高的要求，如何恰當地匹配兩者也是亟待解決的問題[30]。

基因測序技術作為一種高通量基因檢測技術，可大規模、準確地檢測腫瘤基因組、轉錄組及表觀遺傳學的改變，從而為腫瘤發生機制的研究和臨床診療提供強有力的平臺。隨著測序技術的不斷發展、取材手段的改進(如液體活檢ctDNA)、計算機技術的匹配，人類通過基因測序的方法常規進行腫瘤篩查、預防、診斷和治療的目標終將實現。

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劉加強，主任醫師，Email：fhong.ok@163.com

劉德軍，主任醫師，Email：liudejun6721@126.com

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10.3969/J.issn.1672-6790.2016.05.032

2016-07-02)