抑制HPV18型E7蛋白的表達對Hela 細胞生物學特性及miR-204表達的影響

范 幸，周燕飛，祖月娥

(長沙市婦幼保健醫院婦科門診，湖南 長沙 410007 )

抑制HPV18型E7蛋白的表達對Hela 細胞生物學特性及miR-204表達的影響

范 幸，周燕飛，祖月娥

(長沙市婦幼保健醫院婦科門診，湖南 長沙 410007 )

目的 通過小干擾RNA(siRNA)抑制宮頸癌Hela細胞中人乳頭瘤病毒(HPV)18型E7的表達，研究E7蛋白對Hela細胞的生物學特性和miR-204表達的影響和關系，探索HPV致癌的分子機制。方法設計合成靶向HPV18型E7基因的siRNA，轉染Hela細胞，抑制HPV18-E7的表達；采用RT-PCR和Western blot分別檢測Hela細胞中HPV18-E7的mRNA和蛋白水平，用流式細胞術檢測Hela細胞的細胞周期和凋亡，通過熒光實時定量PCR檢測miR-204的表達水平。結果pRNAT-HPVE7與兩個對照組比較，明顯抑制了Hela細胞HPV18-E7的mRNA(t值分別為2.69、2.46，均P<0.05)和蛋白(t值分別為3.93、4.20，均P<0.05)的表達，細胞周期趨于正常，凋亡率增高(t值分別為-6.87、-6.92，均P<0.05)，miR-204表達水平也明顯升高(t值分別為0.26、0.22，均P<0.05)。結論抑制HPV18-E7基因的表達能改變Hela細胞的生物學特性和上調miR-204表達。

小干擾RNA；HPV E7蛋白；miR-204；細胞周期；細胞凋亡

全球每年有50多萬例新發的宮頸癌，而我國每年新發宮頸癌也超過13萬例，其中約8萬例死于宮頸癌，居國內女性惡性腫瘤發病率和死亡率的第2位，且宮頸癌的發病呈逐年上升趨勢。研究發現在約90%宮頸癌組織中可檢測到人類乳頭瘤病毒，其中HPV16/18等高危型HPV感染與宮頸癌密切相關[1]。而人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)的E6、E7蛋白表達是維持腫瘤細胞處于轉化活性狀態所必須的[2]。miRNA是新近發現的內源性非蛋白編碼的單鏈小分子RNAs，長度18～24nt，廣泛存在于動物等多細胞真核生物中。主要通過與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(3'-UTR)的序列互補而在轉錄后水平調控靶基因表達。多項研究顯示，miRNA表達的改變與人類腫瘤發生、發展和病毒感染密切相關[3]。研究HPV致病蛋白與miRNA的關系是探索宮頸癌的發生發展的分子機制的新途徑，為宮頸癌的基因治療提供了新的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究于2014年9月至2015年8月在中南大學肝病研究所完成，相關實驗材料包括：胎牛血清購自Gibico公司，DMEM(高糖)細胞培養基購自HyClone公司，胰酶購自Amresco公司，轉染陽離子脂質體lipofectemin 2000購于美國Invitrogen公司，G418和MTT試劑購自Promega公司，逆轉錄聚合酶鏈反應(Reverse transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)試劑盒購自Fermentas公司。鼠抗HPV18 E7單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體和HRP標記的羊抗鼠IgG均購自Santa Cruz公司，HeLa細胞株為本實驗室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 小干擾RNA的設計與合成

根據Genebank上公布的HPV18-E7編碼基因的序列(Y18491.1)，按照小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)篩選原則獲得多個靶點序列，通過同源性驗證確定與人類基因并無同源，最后篩選獲得一個靶點序列為：CGAGCAATTAAGCGACTCA，再根據靶點序列設計成E7-siRNA：CGAGCAAUUAAGCGACUCA，按照以上步驟設計一條隨機序列的陰性對照NC-siRNA：AGUAGUAACGAUGC￣CACCA，并由上海生工生物工程有限公司合成，并用綠色的異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)作標記，以示蹤siRNA的轉染效率。

1.2.2 Hela細胞的培養和轉染

將宮頸癌Hela細胞株從液氮中取出、復蘇，使用完全培養基(含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基)重懸，置37℃、5%CO2 的培養箱內培養，細胞貼壁生長至80%～90%融合狀態時用0.25%胰酶消化進行傳代培養。將培養的Hela細胞分三組接種到60mm培養皿中，按照說明書，使用陽離子脂質體lipofectemin 2000將對照NC-siRNA和靶標E7-siRNA分別轉染其中兩組細胞，另一個組細胞作為空白對照不作任何處理。細胞轉染24h后更換新鮮培養基，繼續培養至72h，收集細胞。

1.2.3 人乳頭瘤病毒18-E7的mRNA和蛋白表達水平檢測

收集細胞，用Trizol試劑吹打溶解細胞，嚴格按照說明書步驟，提取細胞總RNA。各取2μgRNA進行逆轉錄，按照RT-PCR試劑盒操作步驟合成cDNA，以cDNA為模板，以GAPDH作為內參照，運用PCR擴增目的基因HPV-E7，HPV-E7的上游引物為：5'- ATGCATGGACCTAAGGCA -3'， HPV-E7的下游引物為：5'- TTACTGCTGGGATGCACA -3'，擴增片段的長度為318bp；GAPDH的上游引物為：5'- CAAGGTCATCCATGA￣CAACTTTG -3'，GAPDH的下游引物為：5'- GTCCACCACC￣CTGTTGCTGTAG -3'，擴增片段長度為496bp。PCR條件為：94℃預變性3min，進入循環：94℃變性30sec、60℃退火30sec、72℃延伸30sec,共30個循環，然后72℃延伸7min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分析。實驗重復3次，電泳圖片應用Scion Image軟件分析灰度值，并計算相對定量值,公式為：相對定量值=目的基因灰度值/內參基因灰度值。

收集3組Hela細胞，加入細胞裂解液(50mmoL/LTris pH 8.0，150mmol/L NaCl，1%PMSF，0.1% Aprotinin，1% Trinton X-100)，混勻后置冰上15 min，13 000rpm，離心5min，收集上清液為胞漿蛋白，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。分別取等量蛋白40ug，12%SDS-PAGE電泳，濕式電轉移法把蛋白轉移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，再用3%脫脂牛奶室溫封閉2h。加鼠抗HPV18 E7單克隆抗體為一抗(1：1 000)，以鼠抗人β-actin單克隆抗體為內參抗體(1：2 000)。4℃孵育過夜，PBST洗膜3次。加入HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗(1：2 000)，37℃孵育2 h, PBST洗膜3次。于暗室滴加ECL化學發光液，然后壓片、顯影、定影。實驗重復3次，應用Scion Image軟件分析灰度值，并計算相對定量值,公式為：相對定量值=目的基因灰度值/內參基因灰度值。

1.2.4 流式細胞術檢測3組細胞的周期變化和凋亡水平

分別轉染了對照NC-shRNA和靶標E7-shRNA的細胞和空白對照細胞，培養72h后使用0.25%的胰酶將細胞消化下來，各加入完全培養基終止消化，吹打混勻，2 000rpm離心5min，然后用PBS洗滌細胞一次，2 000rpm離心5min收集細胞沉淀，最后用70%乙醇重懸固定細胞。細胞送北京鼎國生物公司進行細胞流式檢測細胞周期和凋亡。

1.2.5 Real-Time檢測miR-204在3組細胞中的水平

按照Trizol一步法提取細胞中總RNA，并通過分光光度計定量。各取2μgRNA，加入miR-204及U6逆轉錄引物進行逆轉錄，引物序列分別是miR204-RT：5'-GTCGTATCCAGTG￣CAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGGCAT-3'，U6-RT：5'- TTCACGAATTTGCGTGTCAT -3'。轉錄完成后，取cDNA適量加入miR-204或U6擴增引物，對miR-204和U6進行real-time PCR擴增，引物序列分別是：U6-F：5'- CGCTT￣CGGCAGCACATATAC-3'；U6-R：5'- TTCACGAATTTG￣CGTGT￣CAT -3'；Mir204 -F：5'-TCGCCTTCCCTTTGTCATCCT-3'；Mir204-R：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。PCR儀自動讀取熒光數據繪制擴增曲線，最終獲得擴增CT值，按照相對定量的數學模型，根據公式：RQ=2-△△CT，計算出miR-204在3組細胞中的相對表達量，并進行比較和統計學分析。

2 結果

2.1 Hela細胞的培養和轉染

由于合成的siRNA都標記了綠色熒光素FITC，在siRNA轉染后24h即可在熒光顯微鏡下觀察到細胞內的綠色熒光素FITC，而空白對照細胞則無法觀察到綠色熒光，證明NC-siRNA和E7-siRNA均已經成功轉染到Hela細胞中(圖1)。

2.2 RT-PCR和Western Blot分別檢測HPV18-E7的mRNA和蛋白表達水平

RT-PCR結果顯示，HPV18-E7的mRNA在空白對照組細胞(Blank)和隨機對照siRNA轉染細胞(NC-siRNA)中均高表達，而E7-siRNA轉染細胞中HPV18-E7的mRNA表達水平很低，說明E7-siRNA對HPV18-E7的mRNA起到了RNA干擾作用(圖2、圖3)。Wester Blot結果顯示，在空白對照組細胞(Blank)和隨機對照siRNA轉染細胞(NC-siRNA)中，HPV18-E7蛋白質的表達水平均很高。而E7-siRNA轉染細胞中HPV18-E7的蛋白質表達水平很低，說明E7-siRNA對HPV18-E7的蛋白表達水平也起到了很大的抑制作用(圖4、圖5)。

注：Blank為空白對照細胞；NC-siRNA為隨機對照siRNA轉染細胞；E7-siRNA為HPV-E7的siRNA轉染細胞。

注：1.空白對照細胞；2.隨機對照siRNA轉染細胞；3.HPV18-E7的siRNA轉染細胞。

注：* 表示與兩個對照組比較，有統計學差異(t值分別為2.69和2.46，均P<0.05)

2.3 流式細胞術檢測3組細胞的周期變化和凋亡水平

由流式細胞結果可知，兩個對照組之間沒有顯著性差異，而與兩個對照組相比，E7-siRNA組細胞的G1期阻滯，G2期和S期比率相應降低，凋亡率卻明顯升高(見表1、圖6)。

2.4 Real-Time PCR檢測miR-204在3組細胞中的水平

實驗結果顯示，對照組之間比較，miR-204的表達水平并無統計學差異，而E7-siRNA組與兩個對照組比較，miR-204表達顯著升高，這表明HPV18-E7被抑制后上調了miR-204的表達(見圖7)。

注：1.空白對照細胞；2.隨機對照siRNA轉染細胞；3.HPV18-E7的siRNA轉染細胞。

注：*表示與兩個對照組比較，有統計學差異(t值分別為3.93和4.20，均P<0.05)

Blank NC-siRNA E7-siRNA

表1 流式細胞術檢測3組細胞的細胞周期和凋亡率

注：(Blank：空白對照細胞，NC-siRNA：隨機對照siRNA轉染細胞；E7-siRNA：HPV-E7的siRNA轉染細胞。*表示與兩個對照組比較，有統計學差異(t=0.26和0.22，P<0.05)

圖7 Real-time PCR檢測miR-204在3組細胞中的水平

Fig.7 The levels of miR-204 in cells among three groups detected by Real-time PCR

3 討論

3.1 靶向siRNA對Hela細胞HPV18-E7的mRNA和蛋白水平的影響

Hela細胞是取自一位美國婦女的子宮頸癌組織，它是被人乳頭狀病毒第18型(HPV18)感染并轉化的永生化細胞系。1984年，德國病毒學家楚爾豪森利用Hela細胞證明了人乳頭狀病毒(HPV)會導致宮頸癌發生。通過本實驗發現該細胞易于培養、轉染效率高，非常適合對HPV蛋白的功能研究。

本數據表明，E7-siRNA可在mRNA和蛋白質水平上明顯下調HPV18-E7的表達。研究發現，高危型HPV的E6、E7能夠增加外源DNA 插入宿主基因組的頻率，導致在大多數浸潤性宮頸癌均有高危型 HPV 的DNA 插入宿主的基因組；而且高危型HPV的E6和E7整合于宮頸癌宿主細胞基因組后可持續穩定表達E6和E7蛋白，并干擾已發生DNA損傷細胞的依賴于p53的G1期阻滯、DNA修復的過程，從而使宿主DNA不穩定，損傷得以累積，易于致癌[4-5]。HPV18-E7在Hela細胞內高表達，通過下調E7的表達，能觀察到細胞生物學特性和某些關鍵分子的變化，可以初步確定E7在致癌方面的分子機制。

3.2 siRNA靶向HPV18-E7對Hela細胞周期和凋亡的影響

當HPV18-E7蛋白的表達下調后，通過流式細胞術觀察到Hela細胞的G1期阻滯，凋亡率明顯升高。這可能是因為HPV18-E7被siRNA靶向抑制后可上調P53、pRb、P16等細胞周期及凋亡相關蛋白的表達，從而抑制Hela細胞的生長和增殖，并促進了Hela細胞的凋亡[6]。同時也說明HPV18-E7在改變細胞周期和細胞抗凋亡方面的重要作用。

3.3 si RNA靶向HPV18-E7對Hela細胞miR-204水平的影響

miR-204定位于人類9號染色體上73424891～73425000位置之間。成熟的單鏈miRNA分子序列為5'UUCCCU￣UUGUCAUCCU￣AUGCCU3'，miR-204的成熟序列在人、小鼠、大鼠、大象和金魚等脊椎動物中表現為高度保守。近年研究表明miR-204可能成為一種新的抑癌基因，它通過抑制靶mRNA翻譯或誘導靶mRNA降解在轉錄后水平調控基因表達，具有抑癌基因的功能[7-9]。據報道，miRNA-204等在子宮內膜腺癌中與鄰近的非腫瘤性的內膜組織相比，顯著低表達，這對于研究miR-204在HPV感染導致的宮頸癌中的作用起到了指導作用[10]。

通過RNA干擾技術下調Hela細胞內源性病毒蛋白HPV18-E7的表達，還觀察到具有抑癌作用的miR-204水平隨著HPV18-E7蛋白表達的抑制而升高。我們經過軟件預測發現與宮頸癌關系密切的癌基因Ezrin[11]的3'非編碼序列上有miR-204結合的靶點。因此推斷，HPV18-E7可能通過抑制miR-204的表達，來上調Ezrin的表達，這有可能是HPV致宮頸癌的一條分子途徑，其分子機制有待我們進一步驗證和探索，可能為宮頸癌的基因治療提供新的靶標。

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[專業責任編輯：張忠明]

Effects of inhibiting expression of human papillomavirus type18 E7 protein on biological properties of Hela cells and expression of miR-204

FAN Xing, ZHOU Yan-fei, ZU Yue-e

(OutpatientDepartmentofGynecology,ChangshaHospitalforMaternalandChildHealthCare,HunanChangsha410007,China)

Objective To study on the effects of E7 protein on biological properties of Hela cells and expression of miR-204 through inhibiting the expression of human papillomavirus type 18 E7 (HPV18-E7) protein in cervical cancer Hela cells with small interfering RNA (siRNA) so as to explore the molecular mechanism of HPV carcinogenesis. Methods SiRNA targeting HPV18-E7 was designed and synthesized, and siRNA was transfected into Hela cells to inhibit the expression of HPV18-E7. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot were used to assess the level of mRNA and protein of HPV18-E7 in Hela cells. In addition, flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis of Hela cells. Florescent real-time quantitative PCR was used to measure the level of miR-204 expression. Results Compared with two control groups, results showed that pRNAT-HPVE7 could significantly inhibit the expression of mRNA (tvalue was 2.69 and 2.46, respectively, bothP<0.05) and protein (tvalue was 3.93 and 4.20, respectively, bothP<0.05) of HPV18-E7 in Hela cells. Besides, cell cycle showed a tendency to be normal while an increase was witnessed in apoptosis rate (tvalue was -6.87 and -6.92, respectively, bothP<0.05). In addition, a significant increase in miR-204 expression was also seen (tvalue was 0.26 and 0.22, respectively, bothP<0.05).Conclusion Inhibited expression of HPV18-E7 genes can lead to changes in the biological properties of Hela cells and up-regulation of miR-204 expression.

small interfering RNA (siRNA); HPV18-E7 protein; miR-204; cell cycle; apoptosis

2015-09-07

范 幸(1977-)，女，副主任醫師，在讀碩士研究生，主要從事婦科腫瘤的研究。

祖月娥，主任醫師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.06.008

R737.3

A

1673-5293(2016)06-0694-04