持續被動運動對兔骨關節炎軟骨細胞凋亡相關基因P53、caspase-3、Bcl-2和Bax的影響

黃吉利 羅 明 潘 捷 趙鴻聲

(江漢大學附屬醫院骨科，湖北 武漢 430015)

持續被動運動對兔骨關節炎軟骨細胞凋亡相關基因P53、caspase-3、Bcl-2和Bax的影響

黃吉利 羅 明1潘 捷 趙鴻聲

(江漢大學附屬醫院骨科，湖北 武漢 430015)

目的觀察持續被動運動(CPM)對兔骨關節炎(OA)軟骨細胞凋亡及凋亡相關基因P53、caspase-3、Bcl-2、Bax表達的影響。方法 36只新西蘭大白兔隨機分為對照組、模型組、治療組，每組12只。C組兔子在術后第1天即開始進行CPM治療，8 h/d，連續8 w。流式細胞術檢測關節軟骨細胞凋亡情況。RT-PCR和Western印跡方法檢測關節軟骨細胞凋亡相關基因P53、caspase-3、Bcl-2、Bax表達情況。結果 與對照組軟骨細胞凋亡率(8.08±1.23)%相比，模型組軟骨細胞凋亡率(39.85±9.93)%顯著升高(P<0.01)；凋亡相關基因P53、caspase-3、Bax表達出現顯著上調，Bcl-2表達出現顯著下調。給予CPM治療后，與模型組相比，治療組軟骨細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)，凋亡相關基因P53、caspase-3、Bax表達出現顯著下調，Bcl-2顯著上調。結論 CPM可通過影響兔OA膝關節軟骨細胞的凋亡情況，從而改善OA病情，其機制可能與調節凋亡相關基因P53、caspase-3、Bcl-2、Bax表達相關，為臨床上利用CPM治療OA提供了一定的科學依據。

持續被動運動；骨關節炎；軟骨細胞；凋亡

骨關節炎(OA)是一種與年齡相關的退行性疾病，臨床表現為緩慢發展的關節疼痛、壓痛、僵硬、關節腫脹、活動受限和關節畸形等〔1～3〕。OA病理特征是軟骨細胞功能喪失和細胞外基質(ECM)降解。軟骨細胞凋亡改變了軟骨基質的合成，從而導致基質退化和破壞，最終導致OA發病。預防軟骨細胞凋亡已成為目前臨床治療OA的潛在靶標之一〔4，5〕。已知持續被動運動(CPM)在OA治療中具有顯著的療效。然而，CPM治療OA的機制目前還不是很清楚。本研究擬觀察CPM對兔軟骨細胞凋亡相關基因P53、caspase-3、Bcl-2、Bax表達的影響，深入研究CPM治療OA的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性新西蘭大白兔36只，購自重慶醫科大學實驗動物中心〔許可證：SYXK(渝)20070001；動物合格證號：SCXK(渝)20020001〕，體重2.0～2.5 kg，隨機分為對照組、模型組、治療組，每組12只，對照組兔子僅手術切開關節囊而不損傷關節軟骨，術后籠內自由活動；模型組和治療組采用Hulth方法進行造模〔6〕，模型組兔子術后籠內活動；治療組兔子在術后第1天即開始進行CPM，8 h/d，連續8 w。8 w后處死所有兔子。

1.2 軟骨細胞獲取方法 無菌條件下分離兔軟骨組織，并采用眼科剪剪碎至1～3 mm，用Hank液清洗2次，隨后加入0.25%Ⅱ型膠原酶在37℃消化1 h，采用100目孔徑濾網過濾，收集濾過液，1 500 r/min離心5 min，所得沉淀即為兔軟骨細胞。

1.3 凋亡染色方法 獲取的軟骨細胞以RPMI1640重懸并計數。采用Annexin V/7-AAD方法檢測細胞凋亡情況。具體操作方法參見試劑盒說明書。

1.4 RT-PCR Trizol提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA。PCR反應條件：95℃ 5 min，95℃10 s，60℃ 20 s，共40個循環。得到的數據通過比較CT值法(2-△△Ct)進行定量分析。見表1。

1.5 Western印跡方法 采用Novagen公司的Cytobuster提取細胞總蛋白，提取蛋白經10% SDS-PAGE 分離膠和5%濃縮膠分離后，通過濕轉的方法將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，硝酸纖維素膜以含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，加入相應一抗4℃旋轉孵育過夜。次日采用0.1% TBST 洗膜3次，每次5 min，加入山羊抗兔/鼠IgG的HRP標記二抗，室溫旋轉孵育1 h。0.1% TBST 洗膜3次，每次5 min。硝酸纖維素膜以Supersignal West Femto化學發光底物對條帶進行顯色。β-actin作為內參對照。所有實驗至少重復3次。

1.6 統計學方法 采用Graphpad軟件行t檢驗。

表1 RT-PCR檢測基因及引物序列表

基因序列P53正向：5′?GGAGACATTTTCAGGCTTATGG?3′反向：5′?AGAAGGGACAAAAGATGACAGG?3′caspase?3正向：5′?GCACTGGAATGTCAGCTCGCA?3′反向：5′?GCCACCTTCCGGTTAACACGA?3′Bcl?2正向：5′?GGCATGTGCACAGCTGGAT?3′反向：5′?AGAGAGCCAGCAGAAATCAAACA?3′Bax正向：5′?TGCCAGCTGACAAGTATGCT?3′反向：5′?TATAGTGCACACGGCCTTGAG?3′U6正向：5′?GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT?3′反向：5′?CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT?3′

2 結 果

2.1 軟骨細胞凋亡檢測結果 對照組軟骨細胞凋亡率為(8.08±1.23)%，模型組為(30.19±7.21)%，治療組軟骨細胞凋亡率為(11.14±4.03)%，與模型組相比，治療組軟骨細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。

2.2 凋亡相關基因mRNA表達水平檢測結果 與對照組(2.56±0.62，2.15±0.46，1.85±0.06，14.56±2.23)相比，模型組軟骨細胞凋亡相關基因P53(8.13±1.14)、caspase-3(17.5±3.23)、Bax mRNA(4.72±0.60)表達水平顯著上調，Bcl-2 mRNA(1.04±0.86)表達水平顯著下調。給予CPM治療后，與模型組相比，治療組軟骨細胞凋亡相關基因P53(2.67±0.43)、caspase-3(4.17±0.41)、Bax mRNA(2.49±0.08)表達水平出現顯著下調，Bcl-2 mRNA表達水平(12.42±2.14)出現顯著上調。見圖1。

圖1 RT-PCR方法檢測凋亡相關基因表達情況

2.3 凋亡相關基因蛋白表達水平檢測結果 與對照組相比，模型組軟骨細胞凋亡相關基因P53、caspase-3、Bax的蛋白表達水平顯著上調，Bcl-2的蛋白表達水平顯著下調。給予CPM治療后，與模型組相比，治療組軟骨細胞凋亡相關基因P53、caspase-3、Bax的蛋白表達水平顯著下調，Bcl-2的蛋白表達水平顯著上調。見圖2。

圖2 Western印跡方法檢測凋亡相關基因表達情況

3 討 論

CPM在全膝關節置換術恢復治療中療效顯著，在OA治療中也取得一定的成果〔7〕。然而關于CPM治療OA，改善OA病情的機制目前尚未完全研究清楚。軟骨細胞凋亡所致的軟骨退變在OA發生發展中起重要作用〔8,9〕。那么CPM是否可通過改善軟骨細胞的凋亡情況從而改善OA病情目前還未見文獻報道。據此，本研究首先觀察了在CPM治療后軟骨細胞的凋亡情況，結果顯示，在OA模型組軟骨細胞的凋亡情況顯著升高，該結果與文獻報道的軟骨細胞凋亡是OA發病的主要原因相一致〔8,9〕。在給予CPM治療后，軟骨細胞的凋亡水平顯著降低。上述結果提示，CPM可通過改善軟骨細胞的凋亡情況，進而改善OA病情。

細胞凋亡是由多個信號通路調控的一個程序性細胞死亡過程。P53基因介導的細胞信號轉導途徑在調節細胞正常生命活動中起重要作用，與細胞凋亡密切相關〔10〕。caspase蛋白酶是引起細胞凋亡的關鍵酶，其中，caspase-3被認為是各種凋亡刺激因子激活的caspase家族中的關鍵蛋白酶，一旦caspase-3被激活，能將細胞內的蛋白質降解，使細胞不可逆地走向死亡〔11〕。B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)基因是一種原癌基因，已知與內在凋亡途徑密切相關〔12〕。Bax基因主要通過與Bcl-2形成同源或異源二聚體形式發揮作用，當Bax同源二聚體形成時，便誘導細胞凋亡。本研究結果顯示，與對照組相比，模型組軟骨細胞凋亡相關基因P53、caspase-3、Bax的表達水平顯著上調、Bcl-2的表達水平出現顯著下調，該結果與模型組軟骨細胞凋亡水平顯著升高相一致。而給予CPM治療后，與模型組相比，治療組軟骨細胞凋亡相關基因P53、caspase-3、Bax表達水平出現顯著下調，Bcl-2的表達水平出現顯著上調。

綜上所述，本研究結果證實CPM改善兔OA病情的機制可能是改善軟骨細胞凋亡水平。CPM調節軟骨細胞凋亡機制可能與調節凋亡相關基因P53、caspase-3、Bcl-2、Bax表達相關。

1 García-Padilla S，Duarte-Vázquez MA，Gonzalez-Romero KE，etal.Effectiveness of intra-articular injections of sodium bicarbonate and calcium gluconate in the treatment of osteoarthritis of the knee：a randomized double-blind clinical trial〔J〕.BMC Musculoskelet Disord，2015；16(1)：114.

2 Osajie FE，Yakubu K.A retrospective non-comparative analysis of the quality of care for osteoarthritis at the general out-patient department of Jos University Teaching Hospital，Nigeria〔J〕.J Family Med Prim Care，2015；4(2)：217-20.

3 Tsolis KC，Bei ES，Papathanasiou I，etal.Comparative proteomic analysis of hypertrophic chondrocytes in osteoarthritis〔J〕.Clin Proteomics，2015；12(1)：12.

4 Xu Y，Dai GJ，Liu Q，etal.Sanmiao formula inhibits chondrocyte apoptosis and cartilage matrix degradation in a rat model of osteoarthritis〔J〕.Exp Ther Med，2014；8(4)：1065-74.

5 Thomas CM，Fuller CJ，Whittles CE，etal.Chondrocyte death by apoptosis is associated with the initiation and severity of articular cartilage degradation〔J〕.Int J Rheum Dis，2011；14(2)：191-8.

6 Xie GP，Jiang N，Wang SN，etal.Eucommia ulmoides Oliv.bark aqueous extract inhibits osteoarthritis in a rat model of osteoarthritis〔J〕.J Ethnopharmacol，2015；162：148-54.

7 Kitay GS，Koren MJ，Helfet DL，etal.Efficacy of combined local mechanical vibrations，continuous passive motion and thermotherapy in the management of osteoarthritis of the knee〔J〕.Osteoarthritis Cartilage，2009；17(10)：1269-74.

8 Chen Q，Zhang B，Yi T，etal.Increased apoptosis in human knee osteoarthritis cartilage related to the expression of protein kinase B and protein kinase Ca in chondrocytes〔J〕.Folia Histochem Cytobiol，2012；50(1)：137-43.

9 Huang JG，Xia C，Zheng XP，etal.17β-Estradiol promotes cell proliferation in rat osteoarthritis model chondrocytes via PI3K/AKT pathway〔J〕.Cell Mol Biol Lett，2011；16(4)：564-75.

10 Tian X，Zeng G，Li X，etal.Cantharidin inhibits cell proliferation and promotes apoptosis in tongue squamous cell carcinoma through suppression of miR-214 and regulation of p53 and Bcl-2/Bax〔J〕.Oncol Rep，2015；33(6)：3061-8.

11 Na KS，Park BC，Jang M，etal.Protein disulfide isomerase is cleaved by caspase-3 and-7 during apoptosis〔J〕.Mol Cells，2007；24(2)：261-7.

12 Thomas HE，McKenzie MD，Angstetra E，etal.Beta cell apoptosis in diabetes〔J〕.Apoptosis，2009；14(12)：1389-404.

〔2015-12-18修回〕

(編輯 徐 杰)

黃吉利(1979-)，男，碩士，主治醫師，主要從事骨與關節損傷研究。

R68

A

1005-9202(2016)24-6067-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.009

1 湖北醫藥學院附屬太和醫院急診外科