血漿微小RNA-208a、210、506與急性心肌梗死的相關性

李勝男 李玉子

(延邊大學附屬醫院，吉林 延吉 133000)

血漿微小RNA-208a、210、506與急性心肌梗死的相關性

李勝男 李玉子

(延邊大學附屬醫院，吉林 延吉 133000)

目的探討血漿微小RNA-208a、210、506在急性心肌梗死(AMI)早期診斷中的意義及其與AMI嚴重程度的相關性，并進一步探討其在延邊地區朝鮮族與漢族AMI患者間的表達差異。方法 將研究對象分為正常對照組和AMI組，AMI組又分為急診手術亞組、擇期手術亞組和Gensini評分四個亞組。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測血漿miR-208a、210、506相對表達量。結果 AMI組miR-208a、miR-506相對表達量較對照組升高(P<0.01，P<0.05)，miR-210較對照組降低(P<0.01)；急診手術組miR-208a較擇期手術組升高(P<0.05)。三種miRNAs在朝鮮族與漢族間無明顯差異。MiR-208a與年齡、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白Ⅰ(cTnI)、pro-BNP呈顯著正相關，miR-210與年齡、pro-BNP呈負相關，miR-506與低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、CK-MB、cTnI、pro-BNP呈正相關。Gensini評分與miR-208a、miR-506呈顯著正相關，與miR-210呈顯著負相關。結論 MiR-208、210、506可作為AMI的診斷標記物，其中miR-208可能為早期診斷AMI的生物標志物。miR-208a具有評價冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度并進行危險分層的潛力。AMI患者血漿miR-208a、miR-210、miR-506的表達水平無地區、民族差異。

急性心肌梗死；微小RNA；診斷；生物標記

急性心肌梗死(AMI)是一類以心肌缺血缺氧及隨之發生的心肌細胞損傷為主要病理生理變化的心臟病急癥。除了典型胸痛、心電圖及“金標準”冠脈造影等診斷手段外，傳統的血液學檢查〔肌鈣蛋白Ⅰ(cTnI)、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)〕已占據重要地位。微小RNA(miR)是一類普遍存在于生物全血、血漿和血清中的小分子非編碼RNA，參與血管內皮細胞的分化、增殖、凋亡，脂質代謝、氧化應激及動脈粥樣硬化形成等，進而調控眾多的生理和病理生理過程〔1〕。本研究通過檢測血漿miR-208a、miR-210、miR-506的表達水平，探討其在AMI早期診斷中的意義及其與AMI嚴重程度的相關性，同時對比其在延邊地區朝鮮族與漢族AMI患者間的表達是否有差異。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2014年4～9月于延邊大學附屬醫院心內科行冠狀動脈造影檢查及住院治療的AMI患者50例(AMI組)，同期行健康檢查的健康人群27例(對照組)。所有受試者以血常規、腎功、肝功等臨床理化檢查為依據，排除同時合并感染、嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤、近期腦血管病以及自身免疫性疾病等。AMI診斷標準參照2012版第3次心肌梗死全球定義。血清心肌酶學標志物(cTnI、CK-MB)升高(至少超過99%參考值上限)，并至少伴有以下一項臨床指標：(1)心肌缺血癥狀；(2)缺血性心電圖改變：ST-T改變或新發的左束支傳導阻滯；(3)病理性Q波；(4)影像學改變：新的存活心肌喪失或節段性室壁運動障礙；(5)冠脈造影示冠狀動脈主支或分支阻塞或持續性慢血流或無復流或栓塞。

1.2 分組 AMI組按民族分為朝鮮族亞組(20例)和漢族亞組(30例)；按冠脈造影檢查時間分為急診手術亞組(15例)和擇期手術亞組(35例)。采用Gensini評分評價冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度：每處病變的嚴重程度為病變血管解剖部位系數與其狹窄程度系數的乘積，每例患者冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度為每處病變分數之和，最后按照評分分為：A組：積分<30(13例)；B組：30≤積分≤60(24例)；C組：積分>60(13例)。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集 每位受試者于入院后行冠脈造影檢查當日抽取肘部靜脈血約3 ml，室溫下3 000 r/min離心15 min，取上清液至1.5 ml離心管中，-80℃凍存待用。

1.3.2 總RNA提取 取500 μl樣本加1 ml TRIzol(Invitrogen，USA)及0.2 ml氯仿，室溫強烈混勻，4℃ 、13 000 r/min離心15 min后提取最上層透明水相至新的1.5 ml離心管中；加0.5 ml異丙醇后再次同條件離心后可見離心管貼壁形成的白色沉淀即RNA。棄上清，加多于1 ml的現配70%乙醇，同條件離心后吸除乙醇；徹底干燥后加入15～30 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水；用超微量核酸定量儀檢測濃度后-80℃ 凍存。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈(qRT-PCR)檢測3種miRNAs 取每份RNA原液2 μl，加入特異性引物(上海諾倫公司)及MMLV逆轉錄酶等構建反應體系；在16℃、30 min，42℃、30 min，85℃、10 min反應環境中進行逆轉錄，miR-16設為標準內參。最后，每個樣本設置3個反應管，使用實時熒光定量PCR儀(Agilent，Germany)在95℃、3 min，95℃、12 s，60°、40 s反應環境中經40個循環對目的cDNA產物進行qRT-PCR反應。

1.3.4 實驗結果分析 將所采集的Ct值作為樣本表達量標準，采用2-△△Ct法計算miRNAs的相對表達量。

1.3.5 CK-MB、cTnI檢測 通過全自動生化分析儀(Toshiba，Japan)檢測血漿CK-MB、cTnI值。

1.4 統計學方法 應用SPSS22.0及GraphPadPrism6軟件，臨床數據比較采用t檢驗、χ2檢驗、Spearman秩相關和受試者工作特征曲線(ROC)。

2 結 果

2.1 臨床資料分析 AMI組與對照組相比，男性患者所占比例及高齡患者偏多，多有吸煙史，體重指數、TG、CK-MB及cTnI指標較高(P<0.05)；AMI組漢族體重指數、cTnI值較朝鮮族升高，但高血壓頻率較低(P<0.05)。

2.2 miR-208a、210、506相對表達量比較 AMI組miR-208a(7.98±10.19)、miR-506(1.53±1.12)高于對照組(1.02±0.61，0.60±0.52)，miR-210(0.50±0.31)低于對照組(1.28±1.23)；急診手術組miR-208a(9.34±16.10)較擇期手術組(4.66±5.56)升高，miR-210(0.59±0.26 vs 0.56±0.36)、506(1.71±1.16 vs 1.46±1.08)在兩組間無明顯差異。三種miRNAs相對表達水平在朝鮮族與漢族間無明顯差異。

2.3 miR-208a、210、506與冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度的關系 對照組及Gensini評分的三個亞組的miR-208a相對表達量分別為：對照組1.00±0.61、A組3.73±2.27、B組9.74±13.33、C組9.24±6.89，A、B、C三組均較對照組升高，其中B、C組較A組升高(均P<0.05)，但B組與C組無明顯差異；四組miR-210相對表達量分別是：1.25±1.22、0.59±0.34、0.52±0.34、0.39±0.22，A、B、C組均較對照組降低，在三組間兩兩比較均無統計學差異；四組miR-506相對表達量分別是：0.64±0.54、1.17±1.02、1.39±0.99、1.63±1.49，A、B、C組較對照組升高，但三組間兩兩比較均無統計學差異。

2.4 三種miRNAs診斷AMI的敏感性比較 繪制受試者工作特征曲線(ROC)miR-208a、miR-210、miR-506、CK-MB及cTnI曲線下面積分別為0.917(95%CI：0.856～0.979)、0.753(95%CI：0.624～0.882)、0.807(95%CI：0.699～0.915)、0.758(95%CI：0.653～0.864)、0.750(95%CI：0.644～0.856)。由圖1所示，miR-208a、miR-210、miR-506具有早期診斷AMI的能力，但并不優于CK-MB和cTnI。

A：1.miR-208a；2.CK-MB；3.cTnI；4.miR-506；B：1.miR-210圖1 ROC分析

3 討 論

本研究中miR-208a在AMI患者血漿中高表達，其相對含量較對照組顯著升高，此發現與Wang等〔2〕及Oerlemans等〔3〕的研究結果一致，提示miR-208a可作為診斷AMI的新型生物標志物。Ji等〔4〕通過基因芯片技術檢測得出小鼠miR-208只在心肌表達的高組織特異性，且在誘導心肌損傷3 h后逐漸升高，持續12 h后逐漸恢復基礎水平。而這種組織特異性還表現在其他組織器官的低表達，腎臟特異的miR-10a在發生腎梗死時增高，而此時miR-208的水平卻變化不明顯。心肌壞死后miR-208表達升高，含量穩定，且與心肌梗死面積呈正相關。李祥云等〔5〕的研究對miR-208與CK-MB、cTnI相比較分析發現，miR-208不僅對AMI早期診斷具有參考價值，而且還具有一定的時間效應，不僅發病1 h即可檢測到其值升高，且具有相對更寬泛的檢測窗口期。本研究血漿miR-208a表達水平較CK-MB和cTnI開始升高的時間更早，由此可以推測miR-208a具有早期診斷AMI的潛力。

miR-210的表達受缺氧誘導，調控相關基因表達，近年來在包括缺血性損傷及腫瘤在內的多種疾病診治中成為新的靶點〔6〕。Zhao等〔6〕的研究發現心力衰竭患者血漿miR-210表達水平升高，且趨于胎兒水平。除了在心臟疾病的異常表達外，miR-210也影響急性腦缺血性損傷的發生發展機制，但與心力衰竭不同，急性腦梗死患者血清中miR-210表達減弱，且與急性腦梗死嚴重程度有關，可作為急性腦梗死的診斷依據〔7，8〕。急性腦梗死與AMI兩者發病機制相似。有研究〔9〕證實miR-210與低氧誘導因子(HIF)-1α在缺氧誘導環境中表達增高，且協同提高，具有心肌梗死的治療潛力。Wang等〔10〕認為AMI相關基因的表達異?？赡軞w于其各自的調節miRNA表達異常，抑制miR-210的表達能夠提高AMI模型大鼠的生存率和心臟功能。由上可以看出miR-210不僅具有診斷AMI的潛力，更有望成為AMI臨床治療中的新靶點。

研究表明，實體腫瘤細胞因其生長特性實際上是處于一種相對乏氧的狀態〔11〕，無論是腫瘤細胞還是缺血的心肌細胞內，HIF-1α高表達〔12〕也進一步推測兩者具有理化性質相似的內環境。本研究結果顯示AMI組miR-506表達水平高于對照組，提示miR-506有可能作為AMI診斷的新型生物標記物。本研究也發現民族差異不影響血清三種miR表達量變化，是否罹患AMI與民族差異無明顯關系。

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12 Semenza GL.Hypoxia-inducible factor1 and cardiovascular disease〔J〕.Ann Rev Physiol，2014；76(1)：39-56.

〔2015-12-29修回〕

(編輯 袁左鳴)

吉林省科技發展計劃項目(No.20140414065GH)

李玉子(1965-)，女，博士，碩士生導師，主任醫師，主要從事冠心病研究。

李勝男(1990-)，女，碩士，主要從事冠心病研究。

R541.4

A

1005-9202(2016)24-6112-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.031