GPC3、GP73在肝細胞癌臨床診斷中的價值

汪順才 馬潔 朱夢琪 馬久明 周華 虞臘青 楊永峰 經繼生

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GPC3、GP73在肝細胞癌臨床診斷中的價值

汪順才 馬潔 朱夢琪 馬久明 周華 虞臘青 楊永峰 經繼生

目的 評價磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、高爾基體蛋白73(GP73)的高表達對肝細胞癌(HCC)診斷價值。方法對39例HCC、31例肝硬化患者，基線時收集外周血及肝組織，采用ELISA法檢測血清GPC3、GP73的表達量，實時定量逆轉錄PCR法(qRT-PCR)檢測外周血單個核細胞(PBMC)及肝組織中GPC3 mRNA和GP73 mRNA的相對表達量；ROC曲線分析診斷的靈敏度、特異度等指標。結果HCC組GPC3、GP73測量值顯著高于肝硬化組(P<0.001)；GPC3診斷HCC的截斷值> 9.3 μg/L，ROC曲線下面積(AUC)=0.956，靈敏度為89.74%，特異度為96.77%，陽性預測值為97.2%，陰性預測值為88.2%，陽性似然比(+LR)27.82，陰性似然比(-LR)0.11；GP73診斷HCC的截斷值>77.68 ng/mL，AUC=0.937，靈敏度為92.31%，特異度為83.87%，陽性預測值為87.8%，陰性預測值為89.7%，+LR：5.72，-LR：0.092。結論GPC3、GP73在HCC患者中表達明顯增高，且靈敏度顯著優于常規AFP，GPC3、GP73的特異度與常規AFP相近，因此GPC3、GP73有望成為一種新的較好、可靠的HCC無創診斷指標。

磷酯酰肌醇蛋白聚糖3；高爾基體蛋白73；肝細胞癌

肝細胞癌(HCC)在我國發病率逐年上升，目前常規甲胎蛋白(AFP)和超聲檢查篩選方法敏感度、特異度均不能令人滿意，很多HCC患者臨床診斷時已失去有效的治療機會。本研究發現磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、高爾基體蛋白73(GP73)在HCC診斷中具有一定應用價值。

資料和方法

一、一般資料

收集2012年12月至2013年12月句容市人民醫院與南京市第二醫院就診的39例HCC、31例肝硬化患者資料。70例患者中，男性45例，女性25例；平均年齡分別為HCC組(46.2±10.1) 歲，肝硬化(乙型或丙型肝炎)組(49.2±10.3) 歲。無其他肝炎病毒重疊感染，無自身免疫性肝炎重疊。基線時收集患者外周血及肝組織，肝硬化的診斷參照《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》標準[1]，肝癌的診斷參照2011年《原發性肝癌診斷規范》標準[2]。

二、本研究設計是病例對照研究，遵循赫爾辛基宣言和我國頒布的藥物臨床試驗質量管理規范(GCP)，方案經倫理委員會討論通過后執行。

三、觀察項目

血清GPC3、GP73表達量、外周血PBMC及肝組織中GPC3 mRNA和GP73 mRNA的相對表達量、肝組織病理及AFP。肝組織來源于外科手術標本或CT引導下1 s快速穿刺標本。

四、方法

(一)主要試劑及儀器 Taq購自美國Promega公司；肝功能檢測采用美國貝克曼公司自動生化儀；HBV、HCV定量PCR擴增儀為Rotor-Gene 6000(澳大利亞Corbett Research公司)，試劑盒為美國Biosourse公司提供；24孔平底培養板(美國Corning公司)； RNA提取、逆轉錄及qRT-PCR為逆轉錄試劑盒FSQ-101(日本Toyobo公司)；熒光定量試劑盒SYBR○RPremix Ex TaqTMII(日本Takara公司)；GPC3、GP73檢測：上海博研生物科技有限公司生產ELISA試劑；HBVM檢測：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb檢測用ELISA法，按美國Abbott試劑盒說明操作；HBV DNA定量：采用Rotor-Gene 6000(澳大利亞Corbett Research公司)，擴增儀按試劑盒(美國Promega公司)說明操作。

(二)ELISA法檢測血清GPC3、GP73表達量操作步驟

準備試劑，96孔板中加入準備好的樣品和標準品，37℃ 30 min，洗板5次，加入酶標試劑，37℃ 30 min，洗板5次，依次加入顯色液A、B，37℃顯色10 min后加入終止液，15 min之內讀取OD值。以標準品的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的 OD 值由標準曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數(5倍)；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(5倍)，即為樣品的實際濃度。

(三)qRT-PCR法檢測外科手術切除或者肝穿刺肝組織中GPC3 mRNA及GP73 mRNA表達操作步驟

①肝組織細胞用10%胎牛血清的DMEM培養液培養(美國Invitrogen)，加青霉素、鏈霉素使之終濃度分別為100 U/mL，置于37℃，5% CO2的細胞培養箱內。用Trizol試劑(美國Invitrogen)收集細胞后，利用常規酚/氯仿抽提法提取細胞內總RNA和DNA；組織內總RNA和基因組DNA的提取也按照Trizol試劑的說明操作。濃度用NanoDrop1000 (美國Nanodrop)檢測。隨后根據高容量cDNA逆轉錄試劑盒(美國Applied Biosystems)說明將提取的RNA逆轉錄成cDNA。② GP73與β-actin及GPC3與β-actin兩種RT-PCR反應體系：SYBR Premix Ex TaqTM10 μL、上游引物(10 μmol/L)1.6 μL、下游引物(10 μmol/L) 1.6 μL、 模板2 μL、ddH2O 4.8 μL。反應條件 ：95 ℃ 3 min；95 ℃ 40 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 7 min，40 個循環，退火時采集熒光。GP73 上游引物 ：5′ -CAGCGCTGATTTTGAGATGA-3′ ，下游引物 ：5′-ATGATCCGTGTCTGGAGGTC-3′；GPC3上游引物：5′ -TGGACATCAATGAGTGCCTCC -3′，下游引物：5′-CCACATTCTGGTGAGCATTCG-3′；β-actin 上游引物 ：5′-CGTACACTGGCATCGTGAT-3′ ，下游引物 ：5′-GTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3′。GP73及GPC3 mRNA表達水平通過ABI 7500 Real-time PCR System(美國Applied Biosystems)進行檢測。

(四)qRT-PCR法檢測外周血PBMC內GPC3 mRNA及GP73 mRNA表達操作步驟

①外周血PBMC分離：取2 mL全血置于 EDTA 抗凝劑試管中，加入等體積PBS溶液混勻。另準備1個干凈的10 mL離心管，加入4 mL人淋巴細胞分離液，在人淋巴細胞分離液面上1 cm處沿管壁緩慢加入血液與PBS混合液。切記勿破壞液體界面。1500 rpm離心 20 min后，小心吸取云霧狀白膜層，即為PBMC。②將PBMC抽提總RNA后，逆轉錄合成cDNA，最后進行目的基因PCR擴增。GPC3、GP73及β-actin 熒光定量PCR引物由本研究室設計，上海生物工程有限公司合成。GPC3：For：GCCCATTCT-CAACAACGC，Rev：CACTTTCAAACCCTTCCTCAT;GP73: For：CAGCGCTGATTTTGAGATGA，Rev：ATGATCCGTGTCTGGAGGTC;β-actin：For：CG-TACCACTGGCATCGTGAT，Rev：GTGTTGGC-GTACAGGTCTTTG。GP73及GPC3 mRNA表達水平通過ABI 7500 Real-time PCR System(美國Applied Biosystems)進行檢測。

(五) AFP測定

采用Centaur XP化學發光法分析儀及其配套試劑(德國SIEMENS公司)檢測患者血清AFP濃度，按照儀器和試劑說明書進行操作。

(六)MR或CT

五、統計學處理

結 果

一、入選病例基線情況

由表1可見，70例入選本研究的HCC與肝硬化患者在性別、年齡上差異無統計學意義(均P>0.05)，兩組病例的臨床特征具有可比性。

表1 入選病例基線情況

二、兩組病例GPC3、GP73的測量值比較

HCC組：GPC3(15.8±3.86) μg/L、GP73(107.46±29.5) ng/L，肝硬化組：GPC3(7.51±1.38) μg/mL、GP73(65.09±17.23) ng/mL。由此可見，HCC組GPC3、GP73的測量值顯著高于肝硬化組測量值(P<0.001)。GPC3、GP73測量值增高患者中GPC3>9.3 μg/L、GP73>77.68 ng/mL患者發生HCC的風險更高達92.31%。

三、GPC3與GP73診斷HCC的ROC曲線分析

由圖1、圖2可見，GPC3判斷的截斷值>9.3 μg/L，AUC=0.956，靈敏度為89.74%，特異度為96.77%，陽性預測值為97.2%，陰性預測值為88.2%，+LR為27.82、-LR為0.11；GP73判斷的截斷值>77.68 ng/mL，AUC=0.937，靈敏度為92.31%，特異度為83.87%，陽性預測值為87.8%，陰性預測值為89.7%，+LR為5.72、-LR為0.092。

（一）科學規劃產業開發和布局，選址中歐班列（重慶）起點-沙坪壩區土主、回龍壩等鄉鎮區域，打造“一帶一路”現代農業國際合作示范區。從水陸空三大國際樞紐片區來看，江北空港、果園港片區均在兩江新區范圍內，以發展先進制造業和國際物流的產業載體帶動毗鄰村鎮融入國際化，唯有中歐班列（重慶）起點片區缺乏相應能級規格的國際合作示范園區。根據錯位發展原則，建議在中歐班列（重慶）起點附近的土主、回龍壩等村鎮區域選址，集中連片規劃發展“‘一帶一路’現代農業國際合作示范區”。

圖1 GPC3篩檢HCC的ROC曲線

圖2 GP73篩檢HCC的 ROC曲線

四、兩條ROC曲線比較

由圖3可見，GPC3與GP73的AUC差異無統計學意義(P>0.05)；說明兩個指標在早期HCC的預測方面一致。

圖3 GPC3與GP73篩檢HCC的ROC曲線比較

五、qRT-PCR 法檢測PBMC中GPC3、GP73 mRNA表達水平

兩組病例PBMC中GPC3、GP73 mRNA的表達量分別為HCC組：GPC3 (16.94±8.67) μg/L、GP73(12.51±2.97) ng/mL，肝硬化組：GPC3 (15.63±7.35) μg/L、GP73( 14.25±3.67) ng/mL。HCC組GPC3、GP73 mRNA的表達量與肝硬化組比較差異無統計學意義(P>0.05)(見圖4)；推測可能是GPC3、GP73主要是肝癌細胞分泌后釋放入血，所以PBMC中表達差異無統計學意義；具體原因有待進一步研究。

六、ELISA法檢測血清中GPC3、GP73含量的相關性分析

將肝硬化組血清中GPC3、GP73含量做相關性分析，結果顯示，兩個指標的相關系數r=0.6694，具有顯著的正相關關系(P<0.0001)；HCC組血清中兩個指標的相關系數r=0.4645，也具有顯著的正相關關系(P=0.0029)(見圖5)。

七、GPC3、GP73的靈敏度、特異度、陽性預測值及陰性預測值與MR/CT比較

GPC3的靈敏度為89.74%，特異度為96.77%，陽性預測值為97.2%，陰性預測值為88.2%；GP73的靈敏度為92.31%，特異度為83.87%，陽性預測值為87.8%，陰性預測值為89.7%；MR/CT的靈敏度為70%，特異度為98%，陽性預測值為92.3%，陰性預測值為96.3%。由此可見，GPC3、GP73的靈敏度明顯較MR/CT高(P<0.05)，特異度差異無統計學意義(P>0.05)。

八、兩組病例外周血GPC3、GP73濃度值及組織mRNA表達相對值

HCC組：GPC3(16.81±0.56) μg/L、GP73(115.92±7.01) ng/mL；GPC3 mRNA(8.91±3.70) μg/L，GP73 mRNA (68.41±32.86) ng/mL。肝硬化組：GPC3(7.41±0.25) μg/L、GP73(64.63±3.07) ng/mL；GPC3 mRNA (3.04±0.58) μg/L、GP73 mRNA (2.32±0.25) ng/mL。外周血中HCC組GPC3、GP73的測量值顯著高于肝硬化組測量值(P<0.001)；組織中HCC組GPC3 mRNA、GP73 mRNA表達高于肝硬化組(見表2)。

九、GPC3、GP73與AFP的靈敏度及特異度比較

GPC3靈敏度20/23=86.96%(95%CI75.8～97.7)，特異度28/29=96.55%(95%CI83.3～99.9), 陽性預測值20/21=95.24%(95%CI85.2～99.9)；GP73靈敏度21/23=91.31%(95%CI79.1～

圖4 qRT-PCR 法檢測PBMC中GPC3、GP73 mRNA的含量

圖5 ELISA法檢測血清中GPC3、GP73含量的相關性

表2 HCC組及肝硬化組外周血GPC3、GP73濃度及組織中mRNA表達值

98.4)，特異度25/29=86.21%(95%CI66.3～94.5)，陽性預測值21/25=84.01%(95%CI73.8～95.9)。另外通過查閱文獻，將AFP的截斷值定為20 ng/mL[3]，52例患者血AFP值從住院期間化驗結果中獲得(表2)：靈敏度為14/23=60.87%(95%CI40～65),特異度24/29=82.76% (95%CI76～91)，陽性預測值14/19=73.68 %(95%CI9～32)。

十、GPC3、GP73 表達及其病理學特征

HCC組患者中外周血GPC3、GP73濃度及組織mRNA表達水平與年齡、性別、腫瘤大小及肝癌臨床分期間差異無統計學意義(均P>0.05)；而HCC組患者GPC3表達與病理分級間差異有統計學意義(P<0.05)(表3)，病理分級為3級的HCC組患者GPC3低于1～2級患者。

表3 HCC患者血清GPC3、GP73及肝組織相應mRNA表達水平的臨床病理學特征分析

討 論

目前HCC發病率極高，而且在全世界范圍內逐漸上升。HCC患者5年生存率不到10%，是惡性程度最高的腫瘤之一。慢性肝炎病毒感染導致肝纖維化和肝硬化是HCC最主要的危險因素。很多HCC患者臨床診斷時已失去有效的治療機會；如果能夠在早期診斷，包括外科手術切除腫瘤、肝移植、經導管動脈化療栓塞術(TACE)、射頻消融術(RFA)等綜合性治療方法能取得相對較好的效果[4]。2005年，美國肝病學會(AASLD)提出對于HCC高危患者的監測方案，每6個月進行血清AFP和超聲檢查[5]。近年全世界廣泛應用MR/CT，有望比超聲檢查提高靈敏度及特異度。由于檢查的代價及設備的要求使廣大基層難以開展。因此，各國學者從未停止尋找新的更好的HCC腫瘤標志物。理想的腫瘤標志物需要較高的特異度，能夠將HCC與肝硬化、肝炎、肝再生結節區分開來；同時還需較高的敏感度，能夠在HCC早期診斷，且有易檢測、可重復、侵入少的特點。新的基因和蛋白組學技術發展對篩選新的腫瘤標志物提供了很大的幫助。然而，腫瘤標志物從實驗室到臨床應用，還有一個很長的過程。美國癌癥研究所認為一個腫瘤標志物臨床應用前必須經歷以下5個階段：即臨床前研究、臨床驗證、縱向回顧研究、預期檢測、腫瘤控制研究[6]。本課題組研究的兩種HCC的血清標志物在國內外研究概況及水平：(1)GPC3是一種于1995年發現的細胞外糖蛋白，屬于硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)家族的一員，是一種腫瘤抑制物質，可以調節細胞增殖[7]。功能：正常人組織中表達極少，在正常肝組織中不表達，可能在肝臟功能中發揮著重要作用[8]。結構：GPC3基因定位在X染色體上，編碼產物為一具有580個氨基酸，大小為66 kD左右的HSPG。通常GPC3通過C端的糖磷脂酞肌醇連接在細胞膜表面，A358和A359之間的位點被切開可獲得分泌型的可溶性蛋白形式。檢測資料：用RT-PCR檢測mRNA水平上的表達或者用Western blot從蛋白水平上檢測[9]，ELISA法也可以檢測[10]。(2)GP73是 2000 年，由 Kladney等[11]發現的一個高爾基體二型跨膜蛋白，GOLPH2 蛋白定位于細胞高爾基體，且主要位于高爾基體膜順面(Trans)；但同時研究也發現，GOLPH2 可以通過內膜系統轉運到細胞外，并剪切分泌到細胞外基質；而且有可能存在內化，從細胞表面再次回到細胞高爾基體的過程[12-13]。結構：體外轉譯研究表明，其是一個完整的膜蛋白分子，該基因在體內正常翻譯的蛋白在 SDS-PAGE 電泳上表現的分子量為 73 kD；免疫定位研究表明，該蛋白定位在高爾基體上，所以 GOLPH2 最初定名為 GP73。功能：GOLPH2 最先是從新城疫病毒感染研究發現，始終與疾病存在緊密聯系，尤其與肝病關聯。Kladney等[10]研究發現，GOLPH2 與肝臟腺病毒感染相關，肝細胞感染腺病毒后，細胞內 GOLPH2 表達水平顯著升高，同時腺病毒缺失 E1A 的 CTBP 結構域后，上調效果消失；GP73表達與肝纖維化的輕重程度成正相關(肝纖維化程度越重，GP73越高)，患者從肝硬化發展成HCC時GP73表達達到高峰，GP73在HCC患者表達與AFP無明顯的相關性(能夠篩選出AFP假陰性的肝癌)。所以GP73高表達可能與HCC發生、發展有關[14]。檢測資料：用RT-PCR檢測mRNA水平上表達或者用Western blot從蛋白水平上檢測，ELISA法也可以檢測。本研究采用ELISA法對患者血清中GPC3和GP73 的蛋白水平進行檢測，同時利用qRT-PCR法對相同患者PBMC中GPC3 mRNA和GP73 mRNA水平進行檢測。ELISA法結果顯示，HCC組血清中GPC3和GP73的含量顯著高于肝硬化組；GPC3、GP73判斷的靈敏度，特異度，陽性預測值，陰性預測值,約登指數,AUC，似然比(+LR，-LR)均很高；且無論在HCC組還是在肝硬化組，GPC3和GP73兩個指標之間均具有顯著的正相關關系，并且GPC3與GP73的AUC差異無統計學意義(P>0.05)，說明兩個指標在早期HCC的預測方面一致；提示可以根據GPC3和GP73的水平作為診斷HCC的臨床指標。qRT-PCR法結果顯示，根據PBMC中GPC3 mRNA和GP73 mRNA的表達水平，無法區分HCC組和肝硬化組；比國際公認的AFP靈敏度顯著更高，特異度與常規的AFP相近；也比國際公認的MR/CT靈敏度顯著更高，特異度與常規的MR/CT相近。qRT-PCR法所需的檢測標本PBMC較難獲得，整個操作過程技術條件要求高，費用昂貴，MR/CT對基層醫療單位而言設備難以達到，因此均不適宜基層醫療單位開展。相比較而言，ELISA方法簡單，所需檢測標本血清比較容易獲得，患者所付費用明顯降低，同時對基層醫療單位設備的要求可操作性也低。因此GPC3 、GP73有望成為一種新的較好、可靠的HCC無創診斷指標。

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(本文編輯：易玲)

江蘇省衛生廳自然科學基金項目(YG201311)；江蘇大學臨床科技發展基金項目(JLY20120103)

212400 江蘇 句容市人民醫院感染科(汪順才，馬久明，周華，虞臘青，經繼生)；江蘇大學醫學院(馬潔)； 復旦大學附屬華山醫院(朱夢琪)；南京市第二醫院(楊永峰)

經繼生，Email：jrjjs2008@sina.com

2016-07-02)