肥達(dá)氏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)

覃艷春，曾 怡，黃干榮，韋紅玉，陸 鋼

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院/桂西微生物感染研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000）

肥達(dá)氏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)

覃艷春1，曾 怡1，黃干榮1，韋紅玉1，陸 鋼2*

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院/桂西微生物感染研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000）

目的 探討肥達(dá)氏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的改進(jìn)方法，使學(xué)生操作起來更容易，減少試劑用量，縮短試驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間。方法 用移液器加樣，微量孔代替試管，52℃水浴1 h。結(jié)果 微量孔法相對(duì)于試管法操作簡單快速，試劑用量少，反應(yīng)時(shí)間短。結(jié)論肥達(dá)氏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)采用的微量孔法可以代替試管法。

肥達(dá)氏反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)方法；微量孔法

肥達(dá)氏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)是醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的一個(gè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，是應(yīng)用血清學(xué)方法，根據(jù)已知的傷寒桿菌的“O”“H”抗原，甲型、乙型副傷寒的“H”抗原和病人感染傷寒或副傷寒后，約經(jīng)1～2周即可在血清中出現(xiàn)的抗體，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，根據(jù)凝集現(xiàn)象判斷凝集效價(jià)，在臨床上用于輔助診斷傷寒及副傷寒病。

針對(duì)肥達(dá)氏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)存在所用的傷寒診斷血清價(jià)格昂貴，傷寒血清制備費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，反應(yīng)時(shí)間長（24 h）等缺點(diǎn)，近年來有同行對(duì)此反應(yīng)進(jìn)行了改進(jìn)，如丁金龍[1]的聚凝胺法，霍立新[2]的離心法加速了反應(yīng)時(shí)間等。雖然如此，但他們對(duì)肥達(dá)氏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)仍未解決上述全部問題，因此，我實(shí)驗(yàn)室對(duì)此實(shí)驗(yàn)再加以改進(jìn)，用微量孔法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的試管法。在學(xué)生實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過幾年的實(shí)際運(yùn)用效果良好。改進(jìn)前后方法對(duì)比介紹如下。

1改進(jìn)前的實(shí)驗(yàn)方法——試管法[3]

1.1材料

（1）傷寒待測血清[3]1∶20稀釋）。

（2）試劑傷寒沙門氏菌菌體抗原“O”及鞭毛抗原“H”、甲型副傷寒沙門菌鞭毛抗原及乙型副傷寒沙門菌鞭毛抗原，來源于寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.2方法

（1）取潔凈小試管24支，以4排6列擺放在試管架上，試管按順序編號(hào)并標(biāo)記抗原種類。

（2）用5 ml吸管吸取生理鹽水，各管加入0.5 ml。

（3）另取1 ml吸管吸取1∶20稀釋血清，分別加入每排的第1管內(nèi)，每管0.5 ml，吸吹3次充分混合，將血清稀釋為1∶40。

（4）依次類推血清對(duì)倍稀釋至各排第5管、從第5管中吸0.5 ml棄置消毒容器。此時(shí)第2、3、4、5管血清的濃度分別為1∶80，1∶160，1∶320，1∶640。

（5）第6管不加血清，作為抗原對(duì)照管。

（6）加入抗原：第1排各管加入傷寒血清“H”抗原3滴。第2排各管加入傷寒血清“O”抗原0.5 ml。第3排各管加入甲型副傷寒“A”抗原3滴。第4排各管加入乙型副傷寒“B”抗原0.5 ml。

Y2 的模型回歸方程為：Y2=-228.229+43.9125x1+8.79167x2+3.32937x3-6.78333x12-0.389583x22-0.0132083x32+0.3125x1x2-0.0475x1x3-0.001875x2x3。

（7）混勻，置于37℃電熱恒溫水浴箱18～24 h觀察結(jié)果。1.3結(jié)果

（1）觀察對(duì)照管（第6管），管度有圓形沉淀物，搖動(dòng)試管，液體均勻混濁。

（2）從各排第1～5管順序觀察試驗(yàn)管，大部分細(xì)菌被凝集于管底，液體輕度混濁為++。

（3）凝集效價(jià)的確定，以血清的最高稀釋度仍能出現(xiàn)明顯凝集（++）的，為被檢血清的凝集效價(jià)。

2改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)方法——微量孔法

2.1材料

（1）傷寒待測血清[3]1∶20稀釋）。

（2）試劑傷寒沙門氏菌菌體抗原“O”及鞭毛抗原“H”、甲型副傷寒沙門菌鞭毛抗原及乙型副傷寒沙門菌鞭毛抗原，來源于寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

（3）生理鹽水、U型微孔反應(yīng)板、50 μl移液器（來自上海求精生化試劑儀器有限公司）、吸頭、52℃電熱恒溫水浴箱（來自國營創(chuàng)新醫(yī)療器械廠，型號(hào)S648）。

2.2方法

（1）準(zhǔn)備4排微量U型小孔，每排6孔，標(biāo)明記號(hào)。

（2）每孔加入生理鹽水50 μl。

（3）每排第一孔加入待測血清50 μl，混勻，將血清稀釋為1∶40。

（4）進(jìn)行對(duì)倍稀釋，即吸取第1孔50 μl血清放置第2孔，再從第2孔吸取血清50 μl放置第3孔，以此類推連續(xù)稀釋第5孔為止，從第5孔中吸50 μl棄置消毒容器。此時(shí)第2、3、4、5孔血清的濃度分別為1∶80，1∶160，1∶320，1∶640。

（5）第6孔不加血清作陰性對(duì)照孔。（6）每排加入對(duì)應(yīng)的傷寒菌液50 μl。（7）混勻，置于52℃電熱恒溫水浴箱觀察結(jié)果。

2.3結(jié)果

（1）觀察對(duì)照孔，無凝集反應(yīng)，再觀察各孔的凝集情況。

（2）上清液澄清度大約50%，約50%細(xì)菌集成塊沉于孔底記++。

（3）以呈現(xiàn)++凝集現(xiàn)象的血清的最高稀釋倍數(shù)作為該血清的凝集效價(jià)。

3結(jié)論

同一份傷寒血清標(biāo)本，改進(jìn)后的微量孔法跟傳統(tǒng)的試管法結(jié)果（效價(jià)）相同。試管法與微量孔法試劑用量和實(shí)驗(yàn)時(shí)間見表1。

表1 兩種方法使用試劑與時(shí)間的比較

4討論

從上述實(shí)驗(yàn)操作過程和結(jié)論來看，改進(jìn)后的微量孔法相對(duì)傳統(tǒng)的試管法有操作更簡便、試劑用量少、實(shí)驗(yàn)時(shí)間短的特點(diǎn)。任何一門課程、學(xué)科的發(fā)展都會(huì)經(jīng)歷不斷探索、不斷完善的過程[4]，任何實(shí)驗(yàn)技術(shù)也要精益求精，在此思想指引下我們對(duì)該實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)。肥達(dá)氏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)是我校各專業(yè)本科學(xué)生醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容之一，每學(xué)年要做這個(gè)實(shí)驗(yàn)的學(xué)生達(dá)1 200人，在試劑用量上，按照兩個(gè)學(xué)生一組來計(jì)算，肥達(dá)氏反應(yīng)用微量孔法代替試管法可以節(jié)省270 000 μl傷寒血清試劑，“O”、“H”、甲型、乙型傷寒診斷血清各節(jié)省了1 350 000 μl，在節(jié)約教學(xué)經(jīng)費(fèi)的同時(shí)，也更加低碳環(huán)保。在操作上，微量孔法用的是移液器加樣相對(duì)試管法用吸管加樣對(duì)學(xué)生來說操作更簡單，也更準(zhǔn)確。在實(shí)驗(yàn)時(shí)間上，52℃水浴1 h比37℃水浴24 h看結(jié)果節(jié)省了23 h。綜上所述，肥達(dá)氏反應(yīng)微量孔法有諸多優(yōu)點(diǎn)，可以替代試管法推廣使用。

[1]丁金龍，屠文娟.聚凝胺法在肥達(dá)反應(yīng)中的應(yīng)用與評(píng)價(jià)[J].江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，2006，24（4）：381.

[2]霍立新.肥達(dá)反應(yīng)試驗(yàn)的快速法[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，4（5）：431. [3]柳忠輝.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

[4]吳冰，馬煜峰，凌冠華，等.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)課程內(nèi)容改革的探索[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育，2013，15（7）：704-705.

（*通訊作者：陸鋼）

G424.31

B

1671-1246（2016）23-0110-02