代謝綜合征合并哮喘患者TNF-α mRNA表達基因多態性的相關性分析

鞏雪俐 馬琦 孫湛

(1.新疆醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室，新疆 烏魯木齊，830011；2.新疆醫科大學第一附屬醫院臨床醫學研究院，新疆 烏魯木齊，830011；3.新疆醫科大學基礎醫學院機能中心，新疆 烏魯木齊，830011)

代謝綜合征合并哮喘患者TNF-α mRNA表達基因多態性的相關性分析

鞏雪俐1馬琦2孫湛3

(1.新疆醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室，新疆 烏魯木齊，830011；2.新疆醫科大學第一附屬醫院臨床醫學研究院，新疆 烏魯木齊，830011；3.新疆醫科大學基礎醫學院機能中心，新疆 烏魯木齊，830011)

目的 探討代謝綜合征(MS)合并哮喘患者TNF-αmRNA表達及其基因多態性分析。方法 選取119例代謝綜合征患者作為研究對象，其中合并哮喘的患者有47例(MS哮喘組)、單純代謝綜合癥患者72例(單純MS組)，以同期健正常人群60例作為對照，比較各組間TNF-α-308位點基因多態性，并分析其與患者的代謝指標間的關系。結果 (1)病例組中GG、GA+AA等位基因G、A組間分布無顯著差異。MS哮喘組患者的GA+AA基因型分布顯著的高于對照組(P<0.05),單純MS組與MS哮喘組及對照組間GG、GA+AA、G、A無顯著差異。(2)MS哮喘組WHR、BMI、TG、LDL-C、FBG、HOMA-IR、FINS、CRP、TNF-ɑ、TNF-ɑmRNA水平均顯著的高于單純MS組患者，FEV1、FEV1/FVC均低于單純MS組(P<0.05)；其中，與單純MS組相比，MS哮喘組GA+AA基因型患者的差異較MS哮喘組GG基因型患者更為顯著。(3)TNF-ɑmRNA與WHR、BMI、TG、LDL-C、FBG、HOMA-IR、FINS、CRP水平呈顯著的正相關、與FEV1、FEV1/FVC顯著的負相關。結論 MS合并哮喘患者的代謝指標與單純MS患者有顯著的差異，可能與TNF-α-308位點A等位基因的攜帶、TNF-αmRNA表達有關。

代謝綜合征； 哮喘； 腫瘤壞死因子-α； 基因多態性

代謝綜合癥(MS)易引起人體出現代謝異常肥胖、高血壓、高血脂、血糖代謝異常及胰島素分泌障礙等，屬于糖尿病和心腦血管疾病高危致病因素。雖然MS形成機制尚無統一定論，但醫學界普遍認為其除了和人們高脂肪、高熱量飲食及缺乏運動等不健康的生活方式相關外，還和人體內炎癥因子具有密切相關性，而腫瘤壞死因子-α(TNF-α)可能和其具有一定相關性[1]。本文通過檢測本院收治哮喘合并MS患者血清內TNF-α水平的變化情況，同時檢測其血清內血脂、膽紅素、膽固醇等其他指標，以探討TNF-α mRNA表達、基因多態性和哮喘合并MS患者具體關系。

1 材料與方法

1.1 一般材料 納入標準[2]：(1)代謝綜合征的診斷參考中華醫學會糖尿病學分會2004年制定的代謝綜合征的診斷標準，哮喘診斷依據中華醫學會呼吸病學分會制定的哮喘防治指南；(2)對兩組患者均進行相關代謝指標的檢查，對照組研究對象來自于本院體檢中心各項檢查指標均在正常范圍的健康人群；(3)本研究獲得患者的知情同意。排除標準[3]：(1)合并心、肝、腎功能障礙的患者；(2)近期使用糖皮質激素或茶堿類藥物進行治療的患者；(3)近期使用降血脂類藥物治療的患者；(4)合并自身免疫性疾病、血液系統疾病的患者；(5)合并惡性腫瘤的患者。選取本研究收集的119例代謝綜合征患者作為本次研究的病例組，其中合并哮喘的患者有47例(MS哮喘組)、單純代謝綜合征患者72例(單純MS組)，同期健康體檢結果正常的人群60例作為對照組。MS哮喘組患者47例，男20例，女27例， 31～65歲，平均(44.3±10.7)歲；單純MS組患者72例，男30例，女42例， 28～67歲，平均(46.2±11.4)歲；對照組60例健康人，其中男24例、女36例， 34～65歲，平均(45.9±9.2)歲。三組研究對象的年齡、性別構成差異無統計學意義(P>0.05)，具有較好的均衡性。

1.2 觀察指標 測定各組研究對象的人體參數指標，包括：腰圍、臀圍、腰臀比(WHR)、體質量指數(BMI)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹血糖值(FBG)、谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、胰島素抵抗指數(HOMA-IR)、空腹胰島素(FINS)、血清C反應蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子-ɑ(TNF-ɑ)及其mRNA、第1秒用力呼氣容積(FEV1)與用力肺活量(FVC)及其比值。

1.3 檢測方法

1.3.1 生化檢測 檢測前患者保持空腹，無菌環境下于其左肘位抽靜脈血6 mL滴入無抗凝劑試管，靜置約30 min，3 200 r/min離心5 min，取上清液滴入干凈試管，制備好血清樣本，免疫散射比濁法測定樣本的CRP水平，酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測樣本的TNF-α mRNA水平[7]。血清膽紅素、血清膽固醇各項指標測定使用AU2700全自動生化分析儀(購自日本奧利巴斯公司)，DBi、TBi、ALT、AST試劑均購自北京利德曼公司，TG、TC試劑購自中生北控生物科技公司，使用高壓液相層析法檢測血清樣本中FPG、TC、TG，免疫濁度法測定LDL-C、HDL-C，計算WC、WHR、BMI、HOMA-IR，所有指標檢測均在全自動生物化學分析儀中完成。

1.3.2 基因多態性檢測 常規提取血清內TNF-α mRNA樣本約1 μL，加入Oligo(DT)18試劑1 μL(購自上海哈靈生物科技有限公司)，滅菌水蒸12 min，于60 ℃孵育4～6 min，置冰塊上孵育5 min，接著滴入10×反應緩沖液5 μL、PTR擴增產物約18 μL和Rsal內切酶2.5 μL， 反應過夜反應。將檢測樣本凝膠電泳及HB染色，用MSD-2000全自動凝膠成像分析儀(購自北京麥思奇高科技有限公司)檢測產物長度。

2 結 果

2.1 病例組與對照組的TNF-α-308位點G/A基因型表達 病例組中GG、GA+AA(因GA、AA樣本量小，故統計時相加)，等位基因G、A分布于對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 病例組與對照組的TNF-α-308位點G/A基因型表達[n(%)]

2.2 代謝綜合征患者是否合并哮喘分組TNF-α-308位點G/A基因型表達 MS哮喘組患者的GA+AA基因型分布顯著的高于對照組(P<0.05),MS哮喘組的等位基因A分布率顯著的高于對照組(P<0.05)，MS哮喘組與單純哮喘組間GG、GA+AA、G、A比較差異均無統計學意義(P>0.05),單純哮喘組的GG、GA+AA、G、A與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 代謝綜合征患者是否合并哮喘分組TNF-α-308位點G/A基因型表達[n(%)]

2.3 MS哮喘患者于單純哮喘患者的代謝相關指標比較 MS哮喘組患者的WHR、BMI、TG、LDL-C、FBG、HOMA-IR、FINS、CRP、TNF-α、TNF-αmRNA水平均顯著的高于單純MS組患者，FEV1、FEV1/FVC均顯著的低于單純MS組且差異均具有統計學意義(P<0.05)；其余指標在兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 MS哮喘患者于單純哮喘患者的代謝相關指標比較(±s)

2.4 MS合并哮喘患者(MS哮喘組)不同基因型患者的代謝相關指標比較 MS哮喘組GA+AA基因型患者的WHR、BMI、TG、LDL-C、FBG、HOMA-IR、FINS、CRP、TNF-α、TNF-αmRNA水平均顯著的高于MS哮喘組GG基因型患者，FEV1、FEV1/FVC均顯著的低于MS哮喘組GG基因型患者且差異均具有統計學意義(P<0.05)；其余指標在兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 MS不同基因型患者的代謝相關指標比較(±s)

2.5 TNF-αmRNA與MS哮喘患者代謝指標的相關性分析 采用線性相關分析法(Pearson)分析法，TNF-αmRNA與WHR、BMI、TG、LDL-C、FBG、HOMA-IR、FINS、CRP、TNF-α水平呈顯著的正相關關系(r值分別為：0.302、0.317、0.338、0.391、0.402、0.411、0.382、0.371、0.446，P值均<0.05)；TNF-αmRNA與FEV1、FEV1/FVC呈顯著的負相關關系(r值分別為：-0.417、-0.406，P均<0.05)。

3 討 論

哮喘屬于慢性呼吸道炎癥，其患者結構廣泛，其中不乏肥胖及中、高齡患者，且多種炎癥因子及呼吸道結構異變均可誘發該病。哮喘的治療過程漫長，復發性高，患者預后性差，嚴重干擾患者的身體健康及生活質量。由于多數哮喘患者并發心腦動脈血管硬化、高血壓、心肌功能障礙、心律不齊、心臟衰竭、糖尿病及急性腦卒中等疾病，且有研究[5]報道MS是糖尿病和多種心腦血管疾病的高危因素，顯示哮喘患者并發MS概率較高，提出MS致病核心是胰島素抵抗。

研究[6]顯示，TNF-α的基因啟動子轉錄起點上游-308位點多態性與胰島素抵抗及多種類型代謝紊亂具有密切關系，并且該位點也會提高哮喘發病率。本研究中MS哮喘組患者的GA+AA、A基因型分布顯著高于對照組(P<0.05),但其MS哮喘組與單純哮喘組間GG、GA+AA、G、A比較差異及單純哮喘組的GG、GA+AA、G、A與對照組比較差異均不具有統計學意義(P>0.05)。TNF-α-108不同基因段產物的表達不同，這是因為相異基因型分泌蛋白類型不同，故對誘發炎癥類型及影響炎癥程度不同，而環境、遺傳及種族差異也會對哮喘發病機制產生影響，但從整體而言哮喘患者的TNF-α水平是呈現高表達，且并發MS的患者更明顯。我們認為MS本身會引起細胞異常，造成細胞炎癥因子TNF-α濃度升高，同時高濃度的TNF-α反過來加重炎癥程度，進一步惡化哮喘程度。

在本研究中，MS哮喘組患者的WHR、BMI、TG、LDL-C、FBG、HOMA-IR、FINS、CRP水平均顯著的高于單純MS組患者，這表明體質量、代謝功能障礙、炎性因子水平上升均和哮喘發病間存在明切關系，我們認為這可能因為TNF-α-308位點攜帶的基因可導向細胞異變及決定細胞代謝類型。在本研究中，我們發現MS哮喘組GA+AA基因型患者的FEV1、FEV1/FVC顯著低于MS哮喘組GG基因型患者，這可能因為哮喘并發MS患者體內TNF-α-308位點G向A異變后可提高TNF-α濃度水平，造成代謝紊亂，刺激細胞包括肺組織細胞異變，呼吸功能下降，加重哮喘及胰島素抵抗。我們還發現TNF-α mRNA與各項檢測指標水平呈顯著的正相關性，表明TNF-α對代謝功能障礙標識具有高敏感性，其可作為治療哮喘及MS的靶點指標，我們可通過降低其在患者體內濃度水平達到治療目的，同時檢測其水平可評價療效或預測病情發展。

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[2] 劉偉,紀霞. 哮喘患者瘦素受體基因多態性與血清瘦素水平的相關性[J].中國綜合臨床,2013,29(11):1147-1150.

[3] 賈少丹,張為忠. 哮喘病人TNF-α-308位點A/G基因多態性及mRNA表達與代謝綜合征的關系[J].中國免疫學雜志,2013,29(09):960-964.

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