SIAH1在乳腺癌中上調Bim的表達誘導乳腺癌細胞凋亡研究

楊志強，溫媛媛，李春生

SIAH1在乳腺癌中上調Bim的表達誘導乳腺癌細胞凋亡研究

楊志強，溫媛媛，李春生

目的 探討SIAH1在乳腺癌中的表達及對乳腺癌細胞凋亡的影響。方法 采用逆轉錄PCR和免疫印跡試驗法檢測30例乳腺組織與乳腺癌細胞中 SIAH1的表達情況。采用脂質體介導法將 SIAH1表達質粒pcDNA3-myc-SIAH1、對照質粒pcDNA3-myc、SIAH1干擾片段SIAH1siRNA1、對照片段controlsiRNA1、BimsiRNA1及對照片段controlsiRNA2轉染入乳腺癌細胞系MDA-MB-231后，利用逆轉錄PCR和免疫印跡試驗法檢測SIAH1基因在mRNA和蛋白水平的表達情況及對Bim表達的影響，并應用流式細胞儀技術分析檢測SIAH1 對 MDA-MB-231細胞凋亡的影響。結果 SIAH1在乳腺癌組織和細胞中低表達。與乳腺癌細胞系 MDAMB-231轉染對照質粒組相比，轉染pcDNA3-myc-SIAH1后，Bim表達上調，細胞凋亡率增加；干擾SIAH1表達后，Bim表達下調。與乳腺癌細胞系MDA-MB-231轉染pcDNA3-myc-SIAH1相比，共轉染pcDNA3-myc-SIAH1 和BimsiRNA1后，凋亡率明顯減少。結論 過表達SIAH1可通過上調Bim表達來誘導乳腺癌細胞凋亡。

乳腺癌；SIAH1；Bim；細胞凋亡

[Modern Piactical Medicine, 2016,28(6) :713-715,730]

人類有兩個高度保守同源的 SINA，SIAH1和SIAH2，兩者有77%的同一性，但SIAH1和SIAH2蛋白在N端有顯著差別。SIAH1表達在許多正常和腫瘤組織中，發揮誘導細胞凋亡和抑制腫瘤的作用[1]。SIAH1基因在人類肝細胞癌中首先被認為是腫瘤抑制因子[2-3]。研究表明，一些 E3泛素化連接酶如CHFR、SIAH1，與CHIP可調節乳腺癌的發生[4]。另外還有研究發現乳腺癌細胞轉染 SIAH1表達質粒后可通過改變細胞的有絲分裂來抑制細胞生長和誘導細胞凋亡[5]。Bim屬于Bcl-2家族成員之一，是重要的凋亡調節因子，在許多腫瘤的發展中起重要調節作用。DNA損傷、血清饑餓及紫杉醇等刺激可影響Bim的表達來引起細胞的凋亡[6]。Bim可誘導造血細胞，上皮細胞和神經元等細胞的凋亡[7-8]。

近來有研究表明，SIAH1可激活JNK信號通路來調節細胞的凋亡[9]。另外，一些研究發現JNK通路可通過調控Bim來誘導細胞的凋亡[10]。筆者推測SIAH1調節乳腺癌細胞的凋亡可能是通過影響Bim的表達來實現的，報道如下。

1 資料與方法

1.1 細胞培養 乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDAMB-435S與 MCF-7，以及正常乳腺上皮細胞系MCF-10A。3種細胞均為貼壁生長的細胞系。細胞接種在含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100g/ml鏈霉素的DMEM培養液中，在37℃，5%CO2環境下培養。

1.2 主要試劑及方法 DMEM培養液和胎牛血清購自美國GIBCO公司，山羊抗人SIAH1及購于SantaCruz公司，兔抗人Bim購于cellsignal公司，抗 -actin購于北京中杉金橋生物技術有限公司，Lipofect2000購于Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司。PCR引物合成與測序委托大連Takara公司進行。采用逆轉錄PCR（RT-PCR）和免疫印跡試驗（Westernblot）法檢測30例乳腺組織與乳腺癌細胞中SIAH1的表達情況。

1.3 siRNA干擾和細胞轉染 根據siRNA設計原則，選取人SIAH1 mRNA和Bim mRNA中的特異性核苷酸片段為靶目標，應用Ambion公司在線siRNA設計軟件設計SIAH1和Bim的RNAi序列，經Blast確定所選靶向的基因是特異的，序列由上海吉凱基因化學技術有限公司合成。實驗分3組：空白對照組、非特異性siRNA轉染組和特異性siRNA轉染組，每個實驗均重復3次，轉染具體步驟按Lipofect 2000試劑說明書進行。SIAH1siRNA序列：1：5’-AACTCCTGCCTCCTTATGTATTT-3’，2：5’-GAUAGGAACACGCAAGCAA-3’，3：5’-GUUGCAUGUAGUAACACUA-3’。非特異性siRNA1（control siRNA 1）序列：5’-AAGAGCCGTCAGACTGCTACA-3’。Bim siRNA序列：1：5’-ACCGAGAAGGUAGACAAUU-3’，2：5’-CUACCUCCCUACAGACAGA-3’，3：5’-CUACCUCCCUACAGACAG A-3’。非特異性siRNA2（controlsiRNA2）序列：5’-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3’。鑒于轉染效率和穩定性，筆者選擇SIAH1siRNA1和BimsiRNA1進行實驗。SIAH1表達質粒pcDNA3-myc-SIAH1和對照質粒pcDNA3-myc由Matsuzawa Shu-ichi（Burnham Institute，LaJolla，California，USA）教授惠贈。具體轉染步驟按脂質體LipofectamineTM試劑說明書進行。以未轉染的細胞和轉染空載體細胞作為對照。

1.4 Western blot4℃下取1～2g標本，加約5倍濕重的裂解緩沖液，粉碎勻漿后，4℃靜置24 h，低溫高速離心(4℃，12 000 r/min，40 min)，提取上清即為總蛋白。經電泳、轉印，5%正常小牛血清封閉，抗SIAH1(1︰400)和抗 -actin(1︰500)4℃下孵育，過夜；于二抗室溫下孵育2h。ECL顯色，X線膠片曝光成像，經自動電泳凝膠成像分析儀采集圖像。每組結果均為相同條件下重復3次。

1.5 RT-PCR 采用 TrizolTM 試劑提取細胞的總RNA，利用RNAPCRKit(AMV)Ver.3.0試劑盒進行反轉錄。PCR引物為：SIAH1：上游：5’-TCCAACAATGACTTGGC GAGT-3’，下游：5’-CTTTTTCTGTGTGTGGCAGAG-3’；Bim：上游：5’-CTGCAGATATGCGCCCAGAGAT-3’，下游：5'-CACCAGGCGGACAATGTAACG-3’；-actin：上游：5’-AAATCGTGCGTGACATTAA-3’，下游：5’-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3’。PCR產物長度為253bp （SIAH1），167bp（Bim）與513bp（-actin）。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，成像分析。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數生長期的細胞，以1×104/ml的密度接種于細胞培養瓶內，置于37℃CO2孵箱中培養。培養24h后，換無血清的DMEM培養液同步化24h。72h后用0.25%胰蛋白酶消化、離心，收集細胞，預冷PBS洗2次，1000r/min離心8min，棄上清，加PBS600l輕輕吹勻細胞，加RNA酶（終濃度50g/ml）處理30min，37℃。然后加入PI處理15 min，4℃。用流式細胞儀測定細胞周期。sub-G1期細胞代表凋亡[11]。

2 結果

2.1 SIAH1的表達 在30對樣本中，27例乳腺癌組織中SIAH1蛋白表達低于配對的癌旁組織；26例乳腺癌組織中SIAH1mRNA表達低于配對的癌旁組織（封二彩圖4A）。SIAH1蛋白和mRNA在乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7與MDA-MB-435S中表達低于乳腺正常上皮細胞系MCF-10A（封二彩圖4B）。

2.2 乳腺癌細胞中SIAH1與Bim表達的關系 對MDA-MB-231細胞轉染 pcDNA3-myc-SIAH1后發現，SIAH1與Bim表達顯著上調，同時，轉染SIAH1siR-NA后觀察到SIAH1與Bim表達明顯下調（封二彩圖5A）。與細胞轉染pcDNA3-myc-SIAH1相比，細胞共轉染pcDNA3-myc-SIAH1與BimsiRNA1后Bim表達下降。與轉染BimsiRNA1相比，細胞共轉染pcDNA3-myc-SIAH1與Bim siRNA 1后Bim表達上調（封二彩圖5B）。

2.3 乳腺癌細胞凋亡情況 與轉染空載體pcDNA3 （1.11±0.21）%、control siRNA 1（1.14±0.27）%或未轉染細胞（untreated）（1.02±0.26）%相比，MDA-MB-231細胞轉染pcDNA3-myc-SIAH1（18.06±3.35）%后細胞凋亡率明顯增加。MDA-MB-231細胞共轉染pcDNA3-myc-SIAH1 和BimsiRNA1（0.96±0.18）%后，凋亡率與轉染controlsiRNA2（1.04±0.19）%、BimsiRNA1（1.12±0.23）%或未轉染細胞（untreated）（1.02±0.26）%差異無統計學意義（＞0.05），與單獨轉染pcDNA3-myc-SIAH1（18.06±3.35）%相比顯著降低（封三彩圖1）。

3 討論

SIAH1基因位于染色體帶16q12-q13，這個區域在各種腫瘤中經常缺失[11]，這表明SIAH1可能是一種腫瘤抑制因子。Hiroshi等觀察到在Huh7、HepG2細胞中，過表達SIAH1可能通過降解癌蛋白BAG-1，-catenin與PEG10來發揮它的腫瘤抑制作用。在肝癌細胞中，轉染外源性的SIAH1于HCC細胞可誘導細胞的凋亡，表明SIAH1在抑制肝癌的形成中起重要作用[6]，在乳腺癌中SIAH1對其細胞凋亡及其機制的研究尚未報道。

本研究中，筆者采用Westernblot和RT-PCR結果發現，SIAH1蛋白和mRNA在乳腺癌組織和細胞中低表達，這與筆者已報道的免疫組化結果相一致，即 SIAH1蛋白在乳腺正常組織表達高于乳腺浸潤性導管癌。這些結果均提示 SIAH1表達減少或缺失在乳腺癌的癌變過程中起重要作用，這一結果在肝癌細胞中也得到了證實[12]。

為了進一步探討SIAH1對乳腺癌細胞生物學行為的影響和明確SIAH1與Bim的相互關系，筆者轉染了SIAH1表達質粒，發現過表達SIAH1可上調Bim的表達。另外筆者干擾SIAH1表達后發現與之相反的實驗結果。這與Roperch等[13]報道的結果一致。

SIAH1表達增加是通過什么具體機制來誘導乳腺癌細胞凋亡？一些研究表明，p53可使SIAH1轉錄增加，同時SIAH1在p53調節的細胞凋亡中發揮重要作用[13]。另外，SIAH1可通過降解一些癌蛋白BAG1來促進細胞凋亡[14]。有報道稱，SIAH1可通過調節細胞有絲分裂過程來導致細胞凋亡[14]。然而，最近有研究發現，SIAH1可通過激活JNK信號通路來誘導細胞凋亡[9]。許多研究表明JNK信號通路可調節Bim的表達來誘導細胞凋亡[15-16]，所以，筆者推測，Bim 在SIAH1調節的乳腺癌細胞凋亡中發揮一定作用。

為了進一步明確Bim在SIAH1誘導的乳腺癌細胞凋亡中的作用，筆者共轉染了SIAH1表達質粒和Bim小干擾片段，發現過表達SIAH1誘導的乳腺癌細胞凋亡被Bim siRNA抑制了，這一發現更加驗證了過表達SIAH1導致的細胞凋亡是通過調節Bim的表達來實現的。

綜上所述，SIAH1在乳腺癌組織和細胞中表達降低，SIAH1通過調節Bim的表達來誘導乳腺癌細胞凋亡。這些結果提示，SIAH1表達減少或缺失在乳腺癌的癌變過程中起重要作用，且可能依賴Bim來發揮作用。

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SIAH1 induces apoptosis of breast cancer cells by up-regulating the level of Bim

YANG Zhiqiang, WEN Yuanyuan, LI Chunsheng (Wenzhou Meoical University, Wenzhou City 325035, Zhgiang Forvince, China)

Objective To investigate the expression of SIAH1 in breast carcinoma and its effect on the induction of breast carcinoma apoptosis. Methods The expression of SIAH1 mRNA and protein were examined in breast cancer tissues and cell lines by RT-PCR and western blot. MDA-MB-231 cells were transfected with pcDNA3-myc-SIAH1, pcDNA3-myc, SIAH1 siRNA1, control siRNA1, Bim siRNA1 or control siRNA2 by using Lipofectamine 2000. The expression of SIAH1 and Bim were detected by RT-PCR and Western blot. SIAH1-inducing apoptosis of breast carcinoma was detected by Flow cytometry assay. Results SIAH1 mRNA and protein expression were significantly lower in breast cancer tissues and cell lines. Compared with the control and the cells transfected with the pcDNA3-myc, the level of SIAH1 and Bim were increased in the cells transfected with the pcDNA3-myc-SIAH1. And the apoptosis percentage was also increased. On the contrary, the level of SIAH1 and Bim were decreased in the cells transfected with the SIAH1 siRNA1. Conclusions Overexpression of SIAH1 can induce apoptosis of breast carcinoma by up-regulating the level of Bim.

Breast carcinoma; SIAH1; Bim; Apoptosis

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.06.006

R737.9

A

1671-0800(2016)06-0713-04

2015-12-10

（本文編輯：鐘美春）

國家自然科學基金（青年科學基金項目）（81201853）；浙江省自然科學基金項目（Y2110620、Y2111209）

316000浙江省舟山，舟山醫院（楊志強、李春生）；溫州醫科大學（溫媛媛）

溫媛媛，Email:wenyuanyuan1022@sina.cn