1型糖尿病小鼠腸道潘氏細胞的殺菌功能改變

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·基礎研究論著·

作者單位：510120 廣州，中山大學孫逸仙紀念醫院消化內科

1型糖尿病小鼠腸道潘氏細胞的殺菌功能改變

1型糖尿病是以慢性血糖升高為特征的代謝性疾病，主要由胰島B細胞破壞，胰島素絕對缺乏引起[1]。近年來，越來越多的臨床調查研究提示1型糖尿病患者發生腸道細菌、病毒和真菌等病原體感染的幾率顯著增加[2-4]。在正常機體中，腸道黏膜的屏障功能是維持機體內外穩態的重要基礎。其中，腸道黏膜上皮隱窩底部的潘氏細胞所分泌的溶菌酶在保持腸道菌群平衡以及抵御病原生物侵襲等方面起著極其重要的作用[5-6]。

研究顯示，在腸道潘氏細胞的分化、成熟過程中主要受Wnt和Notch信號通路調控[7]。本實驗組的前期研究發現，包括潘氏細胞在內，1型糖尿病小鼠的各種腸上皮細胞均存在分化比例的改變[8]。然而，在1型糖尿病的病理狀態下，機體中的胰島素絕對缺乏，除了誘發腸上皮細胞分化比例異常，是否影響潘氏細胞的成熟及其殺菌功能，目前相關報道不多，還需要進一步研究探討。因此，本研究旨在探討在1型糖尿病小鼠模型中腸道潘氏細胞殺菌功能的改變，以及恢復胰島素水平對其功能的影響，為糖尿病腸道感染的相關研究提供實驗依據。

材料與方法

一、主要試劑

鏈脲菌素購自Sigma公司；檸檬酸購自廣州化學試劑廠；中性魚精蛋白胰島素購于諾和諾德公司；ELISA試驗盒購于Merck Millipore公司；大腸埃希菌K12 ER2738菌株購于New England Biolabs公司，兔抗小鼠溶菌酶抗體購于Santa Cruz公司；免疫組織化學檢查SP試劑盒購于邁新公司。

二、實驗動物

實驗動物為C57BL/6J小鼠，共30只，雌雄各半，8周齡，購于中山大學北校區實驗動物中心，在中山大學北校區實驗中心屏障環境中飼養。所有有關動物的實驗過程均在中山大學實驗動物倫理委員會的監督指導下完成，符合實驗動物倫理學要求。

三、實驗方法

1.糖尿病小鼠模型的建立

將30只C57BL/6J小鼠隨機分為3組，每組10只：正常對照組(Control組)、1型糖尿病組(UDM組)、胰島素治療組(IDM組)。1%鏈脲菌素溶液由無菌0.1 mol/L檸檬酸緩沖液(pH=4.5)溶解鏈脲菌素制成，并立即對UDM及IDM組小鼠行腹腔內注射，劑量為70 mg/kg，1次/日，連續5 d。Control組給予相同體積的無菌0.1 mol/L檸檬酸緩沖液腹腔內注射，1次/日，連續5 d。1型糖尿病模型建模成功的條件為長期維持血糖大于16.7 mmol/L[9-10]。IDM組則給予造模成功的糖尿病小鼠皮下注射0.08 IU中性魚精蛋白胰島素，每日2次，直至實驗結束[11-12]。第14周處死小鼠，沿腹部正中線行切開腹腔，取出靠近回腸末端10 cm片段進行后續實驗。

2.ELISA檢測血漿胰島素水平

于試驗終點時，使用心臟穿刺取血的方法抽取其血液進行離心(2 000×g, 4℃，15 min)，根據ELISA試劑盒說明書進行操作。根據標準曲線，檢測各組血漿胰島素水平。

3.菌落培養法評估腸道細菌增殖情況

取腸道片段進行研磨、稀釋，然后取相同體積稀釋液接種于培養平板。對于需氧細菌的培養，稀釋液接種于胰蛋白胨大豆瓊脂平板，在37℃的有氧環境中培養24 h；對于厭氧細菌的培養，稀釋液接種于兔血瓊脂平板，在37℃的無氧環境中培養48 h。最后平板上的菌落克隆數目計數，換算為單位質量腸道細菌總數(CFUs)。

4. 菌落培養法評估腸道對大腸埃希菌的清除能力

在第14周，用灌胃法注入0.1 ml碳酸氫鈉溶液(0.1 M)，然后立即注入0.1 ml的大腸埃希菌溶液(2×1010CFUs)。該大腸桿菌為K12 ER2738菌株，對四環素耐藥。3 h后殺死小鼠，收集腸道組織，進行研磨、稀釋，然后取相同體積稀釋液接種于含20 mg/L四環素的培養平板。統計平板上的細菌克隆數，計數單位體積細菌總數。

5.免疫組織化學法檢測腸上皮溶菌酶的定性表達

組織切片行脫蠟、水化后，過氧化酶阻斷劑孵育10 min，非免疫羊血清孵育10 min，溶菌酶一抗(1∶2 500稀釋)4℃孵育過夜，二抗37℃孵育30 min，鏈霉素抗生物素過氧化物酶孵育10 min，二氨基聯苯胺顯色5 min，磷酸鹽緩沖液終止顯色，蘇木素復染30 s。封片后光鏡下觀察溶菌酶陽性細胞的位置及表達情況。由2位研究者獨立閱片，在400倍的觀察條件下，計算視野中每個完整小腸隱窩單位溶菌酶陽性細胞的數目。隨機選擇15個視野計數分析，取其平均值。

6.蛋白免疫印跡法檢測腸上皮溶菌酶的定量表達

腸組織研磨后用RIPA緩沖液提取蛋白，提取液在12%聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳分離，然后電轉至PVDF膜上。膜在溶菌酶一抗(1∶2 500稀釋)或β-actin一抗(1∶2 000稀釋)中4℃輕搖孵育過夜，在辣根過氧化物酶偶聯的二抗室溫孵育30 min。最后加入顯色液，避光顯色至出現條帶。運用Glyko BandScan 5.0分析蛋白條帶的灰度，以β-actin為內參。

四、統計學處理

結果

一、Control組、UDM組、IDM組的血糖和血漿胰島素水平比較

與Control組比較，UDM組血糖明顯升高(P<0.01)；接受胰島素治療可使IDM組小鼠血糖恢復正常，與Control組比差異無統計學意義(t=0.776，P>0.05)。UDM組血漿胰島素水平較Control組明顯下降(P<0.01)，而在胰島素替代治療的IDM組小鼠中，其胰島素水平明顯升高，與Control組比較差異無統計學意義(t=0.778，P>0.05)，見表1。

表1Control組、UDM組、IDM組的

注：與Control組比較，t血糖=20.170,t血漿胰島素=12.332，aP<0.01

二、Control組、UDM組、IDM組的需氧菌總數、厭氧菌總數比較

與Control組比較， UDM組小鼠回腸末端的需氧菌總數多(P<0.05)；UDM組厭氧菌總數也較Control組多(P<0.05)；胰島素治療后的IDM組腸道需氧菌和厭氧菌總數均低于UDM組，與Control組比較差異無統計學意義(t需氧菌=0.162，t厭氧菌=0.305，P均>0.05)，見表2。

表2Control組、UDM組、IDM組的

注：與Control組比較，t需氧菌= 2.599，t厭氧菌=2.220，aP<0.05

運用灌胃法注入耐四環素的大腸埃希菌K12 ER2738菌株，該菌株在UDM組中的存活數明顯高于Control組及胰島素治療后的IDM組(圖1；P<0.05)，而IDM組同Control組比較無統計學差異(P>0.05)。上述結果提示，糖尿病小鼠的回腸末段細菌增多，抑菌能力減低。

圖1　Control組、UDM組、IDM組大腸埃希菌

三、糖尿病小鼠回腸末端潘氏細胞溶菌酶表達減低

免疫組織化學結果顯示，溶菌酶分子主要表達在腸隱窩底部的潘氏細胞的胞漿中，呈黃色或棕黃色顆粒(圖2)。UDM組小腸上皮平均每個隱窩的溶菌酶陽性細胞數為(5.75±1.00)個，Control組為(4.46±0.96)個，2組比較差異有統計學意義(t=3.013，P< 0.05)；而IDM組和Control組對比無統計學差異[(4.39±0.85)個vs.(4.46±0.96)個,t=0.151，P>0.05]。蛋白免疫印跡法結果顯示，UDM組的溶菌酶表達強度低于Control組(0.39±0.16vs. 0.79 ± 0.12，t=6.018,P< 0.01)；而IDM組和Control組對比無統計學差異(0.79 ± 0.16vs. 0.79 ± 0.12，t=0.081，P> 0.05)，見圖3。

圖2　Control組、UDM組、IDM組回腸末端潘氏細胞溶菌酶表達(免疫組織化學染色)

圖3　Control組、UDM組、IDM組小鼠腸道

討論

糖尿病腸道感染是糖尿病患者的常見并發癥之一。近年來，一系列臨床調查研究提示，1型糖尿病患者更容易發生腸道細菌、真菌、病毒等病原體感染，主要表現為腹痛、腹瀉、吸收不良等臨床表現，也可以呈無癥狀的隱性感染狀態[1-4]。然而，其中的具體機制尚未完全闡明，目前考慮可能與內臟神經病變、胃腸運動障礙、腸道激素分泌紊亂等多個因素有關[13]。

Roza等[14]研究發現，1型糖尿病大鼠腸道細菌負荷增加，并且出現異常的細菌菌株，提示在腸道感染發生前可能已經存在腸道菌群的紊亂及細菌的過度生長。本次研究的結果表明，1型糖尿病小鼠在血糖持續升高后出現了回腸末端需氧菌和厭氧菌數量的明顯增加，這與Roza等[14]研究相符，同時提示1型糖尿病小鼠可能存在腸道抑菌功能的下降，與其易發生腸道細菌感染有關。

為了評價1型糖尿病小鼠腸道的易感性，本課題組采用了K12 ER2738大腸埃希菌的菌株進行灌胃，并收集糞便進行四環素下的糞便細菌培養，這一方法可以有效去除腸道既有菌量、菌群的差異對研究結果的影響。結果顯示，耐四環素的大腸埃希菌更容易在血糖升高的UDM組1型糖尿病小鼠腸道中存活。這進一步證明了1型糖尿病小鼠腸道對細菌的防御功能下降，清除病原體能力下降，對外來病原體的易感性增加。

腸道黏膜上皮隱窩底部的潘氏細胞可以產生及分泌溶菌酶，這一功能蛋白在局部腸道抑菌和防御作用方面發揮著重要的作用。本課題組既往的研究表明，1型糖尿病小鼠模型中腸道潘氏細胞數量增加，同時Notch/Hes1通路的表達減低提示其分化受抑制，但對其合成、分泌溶菌酶的狀態及其抑菌功能未行進一步探討[8]。本次研究表明，潘氏細胞在持續血糖升高后的1型糖尿病小鼠回腸末端的數量稍增加，同時，其產生及分泌的溶菌酶卻明顯減低。這一數量增加、功能減低的矛盾狀態，提示1型糖尿病對小鼠腸道潘氏細胞的分化產生了抑制作用。

上述的潘氏細胞功能異常是否與1型糖尿病的低胰島素水平有關，目前尚不清楚。本課題組采用的1型糖尿病小鼠模型原理是鏈脲菌素破壞胰島細胞，導致其分泌胰島素不足。結果顯示，UDM組小鼠的胰島素水平明顯減低，而胰島素替代治療后的IDM組可使胰島素水平恢復至正常對照小鼠的水平。后續的觀察發現，1型糖尿病小鼠接受胰島素替代治療后，潘氏細胞的數目及其溶菌酶表達水平均可恢復至正常狀態。同時，腸道細菌菌量及K12 ER2738大腸埃希菌的抑制作用也與對照組無統計學差異，提示胰島素替代治療恢復血糖水平后腸道局部的抑菌能力也得到恢復。這些結果證明潘氏細胞的功能障礙可以被胰島素替代治療所改善，同時，隨著潘氏細胞功能的恢復，腸道的防御能力也得以提高。

綜上所述，1型糖尿病小鼠腸道局部防御能力下降與潘氏細胞分泌溶菌酶減低有關，而胰島素替代治療可以恢復潘氏細胞溶菌酶的表達及腸道的抑菌能力。

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(本文編輯：楊江瑜)

楊洪生盧錫基于濤歐陽慧陳其奎

【摘要】目的探討1型糖尿病小鼠腸道潘氏細胞殺菌功能的改變。方法采用腹腔注射鏈脲菌素的方法誘導1型糖尿病小鼠模型，8周齡小鼠分為正常對照組(Control組)、糖尿病組(UDM組)和糖尿病胰島素治療組(IDM組)。采用菌落培養法評估腸道細菌增殖情況及對外來大腸埃希菌的殺滅能力。利用免疫組織化學法和蛋白免疫印跡法檢測潘氏細胞內溶菌酶的表達情況。結果與Control組比較，UDM組回腸末端有氧細菌總量增加(UDM組：5.66±0.80 lg CFUs/g，Control組：4.70±0.81 lg CFUs/g，P<0.05)，厭氧細菌總量也增加(UDM組：6.71±1.37 lg CFUs/g，Control組：5.25±1.16 lg CFUs/g，P<0.05)；UDM組腸上皮每個隱窩內潘氏細胞數目增多(UDM組：5.75±1.00個，Control組：4.46±0.96個，P<0.05)，但溶菌酶的蛋白質表達下降。IDM組與Control組比較，潘氏細胞數目、溶菌酶的蛋白質表達、腸道的細菌總量比較差異無統計學意義。結論1型糖尿病小鼠腸道防御能力下降，與潘氏細胞分泌溶菌酶不足有關，而胰島素替代治療可以恢復潘氏細胞溶菌酶的表達及腸道的防御能力。

【關鍵詞】1型糖尿病；潘氏細胞；溶菌酶；胰島素；腸道細菌

Changes in bactericidal function of intestinal Paneth cells in type 1 diabetic miceYangHongsheng,LuXiji,YuTao,OuyangHui,ChenQikui.DepartmentofGastroenterology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China

Correspondingauthor，YuTao,E-mail:yutao2014@126.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the changes in the bactericidal function of intestinal Paneth cells in type 1 diabetes mellitus (T1DM) mouse models. MethodsT1DM mouse models were established by intraperitoneal injection of streptozocin (STZ). The 8-week-aged mice were divided into the control(Control), STZ-induced diabetic mice (UDM) and insulin-treated diabetic mice (IDM) groups. Bacterial culture was performed to evaluate the bacterial proliferation in the intestine and the bactericidal ability to eliminate foreign Escherichia coli. The expression level of lysozyme in intestinal Paneth cells was detected by immunohistochemistry and western blot. ResultsCompared to the Control group, the aerobe load of terminal ileum in the UDM group was significantly increased (UDM group：5.66±0.80 lg CFUs/g，Control group：4.70±0.81 lg CFUs/g，P<0.05), so was the anaerobe load (UDM group：6.71±1.37 lg CFUs/g，Control group：5.25±1.16 lg CFUs/g，P<0.05) and the quantity of Paneth cells in each crypt of intestinal epithelial cells (UDM group：5.75±1.00 per crypt，Control group：4.46±0.96 per crypt，P< 0.05). However, the expression level of lysozyme in the UDM group was decreased compared with that in the control group. No significant difference was noted between the IDM and control groups in terms of the quantity of Paneth cells, the expression level of lysozyme and overall bacterial load in the intestine. ConclusionsThe intestinal bactericidal function of the T1DM mice was decreased, which may result from the insufficient secretion of lysozyme by the Paneth cells. The insulin treatment can enhance the expression of lysozyme and restore the bactericidal function of the intestine in the T1DM mice.

【Key words】Type 1 diabetes mellitus; Paneth cells; Lysozyme; Insulin; Intestinal microbiota

收稿日期：(2015-08-06)

通訊作者，于濤，E-mail：yutao2014@126.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81370475)

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.01.005