腎胺酶預防大鼠缺血再灌注致急性腎損傷的機制研究

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·基礎研究論著·

作者單位：510120 廣州，廣州醫科大學附屬第一醫院腎病科

腎胺酶預防大鼠缺血再灌注致急性腎損傷的機制研究

急性腎損傷(AKI)在住院患者中的發病率達21.6%，病死率達23.9%，并加快慢性腎衰竭的進展速度，因此對其的診斷及防治是臨床和基礎研究的熱點[1-3]。AKI的病因多種多樣，其中以缺血再灌注損傷(IRI)最常見。腎胺酶是近年來發現的、主要由腎小管上皮細胞合成和分泌并降解循環系統中兒茶酚胺的蛋白質，對其研究領域最初主要集中在心血管系統，后來發現其能夠改善缺血再灌注(IR)引起的器官損傷，譬如心臟、腦和腎臟等[4-7]。但是，目前有關腎胺酶對IR所致AKI(IR-AKI)的預防作用，其具體機制尚未完全闡明，因此進一步探討腎胺酶預防IR-AKI的機制，為其在AKI的應用具有重要意義。本研究構建IR-AKI的大鼠模型，予外源性人重組腎胺酶預處理，旨在了解外源性人重組腎胺酶對IR-AKI的影響，并探討其可能機制。

材料與方法

一、實驗動物與主要試劑

實驗用SD大鼠由南方醫科大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK-(粵)2011-0015。實驗方案通過廣州醫科大學動物倫理審查委員會審核批準，實驗在廣州醫科大學實驗動物中心完成。重組人腎胺酶購自以色列ProSpecbio公司；兔抗鼠Bax及Bcl-2多克隆抗體均由武漢博士德公司提供，山羊抗兔二抗由北京中杉金橋公司提供，丙二醛由南京建成生物工程研究所提供。

二、方　法

1. 動物分組

36只SD雄性大鼠適應性喂養7 d后隨機分為假手術組、空白對照組(IR組)、腎胺酶干預組(IR+腎胺酶組)，每組各12只。

2. IR-AKI大鼠模型的構建

參照文獻[8]方法，建立IR-AKI的SD大鼠模型：10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉生效后，腹正中線行一3~4 cm切口，找到左腎門，分離輸尿管游離出左腎蒂；動脈血管夾夾閉腎蒂，肉眼可見左腎由鮮紅轉為暗紅，最后呈紫黑色，30 min后松開血管夾，待觀察左腎充血由紫黑轉暗紅再轉為鮮紅色后，腎表面可見散在出血點，切除右腎，縫合切口。假手術組大鼠僅游離出雙側腎蒂，不夾閉腎動脈，傷口用生理鹽水紗布覆蓋，30 min后縫合切口。IR+腎胺酶組按照文獻[9]方法，麻醉前20 min腹腔注射重組人腎胺酶(1 mg/kg)；IR組麻醉前腹腔注射等劑量0.1 ml生理鹽水。18 h后3組大鼠麻醉后開腹，下腔靜脈采血后全部處死，血液經高速離心后留上清血漿于-20℃保存，留取左腎組織行石蠟切片。

3. 腎臟組織病理改變的觀察

3組SD大鼠腎臟組織的石蠟切片經常規蘇木素-伊紅染色后，觀察及評估其腎臟組織損傷的程度，包括腎小管上皮細胞水腫、壞死，腎小管萎縮、擴張，炎癥細胞浸潤等，采用腎小管損傷指數進行評估。每張切片在高倍鏡視野(×400)下取外髓皮質部10個視野，半定量分析腎小管損傷指數：①正常，計0分；②輕微損傷，指受損腎小管<5%，計1分；③輕度損傷，指受損腎小管占5%~25%，計2分；④中度損傷，指受損腎小管占26%~75%，計3分；⑤重度損傷，指受損腎小管>75%，計4分。比較3組SD大鼠的腎小管損傷指數。

4. 腎臟組織Bcl-2及Bax蛋白表達檢測

采用免疫組織化學(IHC)染色法，對3組SD大鼠腎臟組織的石蠟切片按常規程序脫蠟及抗原修復，3%H2O2滅活內源性酶，用山羊血清封閉，然后嚴格按說明書進行兔抗大鼠Bax免疫組織化學染色和兔抗大鼠Bcl-2免疫組織化學染色。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，在腎臟中主要表達于腎小管上皮細胞，陽性表達為棕黃色或黃褐色。Bax蛋白可促進細胞凋亡，也是主要表達于腎小管細胞胞漿中，陽性表達為棕黃色或黃褐色。先在光鏡低倍視野(×100)下觀察反應結果，然后用IPP 6.0軟件計算高倍視野(×400)平均光密度(OD值)，根據光密度值分析3組SD大鼠的Bax及Bcl-2蛋白表達情況。

5. 腎功能指標的檢測

采用日本奧林巴斯AU2700全自動生化分析儀檢測3組SD大鼠的血清肌酐和血尿素氮水平。

6. 血清丙二醛水平的檢測

嚴格按照說明書采用硫代巴比妥酸(TBA) 法測定3組SD大鼠的血清丙二醛水平，用分光光度計記錄532 nm處OD值，再將數據代入公式，算出血清丙二醛含量。每次檢測重復操作2次，結果取平均值。

三、統計學處理

結果

一、大鼠腎臟組織形態學改變

1. 總體表現

假手術組大鼠腎臟外觀形態、色澤和大小正常，外表面呈鮮紅色，冠狀切面可見色澤從皮質到髓質由淡紅向深紅顏色加深；IR組腎臟體積增大，顏色為紫紅或紫黑色，表面有散在的出血點，冠狀切面可見皮質蒼白，腎髓質淤血。IR+腎胺酶組介于兩者之間。

2.光鏡下觀察

經蘇木素-伊紅染色后，假手術組SD大鼠的腎小球和腎小管區未見異常，腎小球完整，結構清晰，球囊比例正常；腎小管管腔基底膜完整，可見刷狀緣，見圖1A。IR+腎胺酶組可見局部腎小球膨大，腎小囊裂隙變窄，球囊比輕度增大；腎小管基底膜基本完整，腎小管上皮細胞輕度腫脹，空泡樣和玻璃樣變，部分近端小管上皮細胞刷狀緣缺失或脫落，偶見管腔淡紅色染色；腎間質輕微水腫，局部有少量炎癥細胞浸潤，見圖1B。IR組球囊比明顯增大，偶可見腎小囊基膜破裂；腎小管上皮細胞彌漫腫脹和壞死，胞漿呈空泡狀，刷狀緣基本缺失，管腔充滿碎片；腎間質水腫，炎癥細胞浸潤，比IR+腎胺酶組更嚴重，見圖1C。

圖1　假手術組、IR+腎胺酶組、IR組SD大鼠的腎臟病理檢查結果(蘇木素-伊紅染色，×400)

3. 3組SD大鼠的腎小管損傷指數比較

經IR處理18 h后，假手術組、IR+腎胺酶組、IR組的腎小管損傷指數分別為0.15±0.03、1.70±0.23、3.51±0.40，3組間比較差異有統計學意義(F=312.548，P<0.001)，組間兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.001)。

二、3組SD大鼠腎組織的Bcl-2和Bax蛋白表達水平比較

1. Bcl-2

假手術組可見腎小管上皮細胞少量Bcl-2陽性表達，而IR組Bcl-2陽性細胞多于假手術組，IR+腎胺酶組的Bcl-2陽性細胞均較假手術組和IR組增多，見圖2。假手術組、IR組、IR+腎胺酶組Bcl-2的OD值分別為28.6±4.1、81.5±7.2、148.3±7.6，3組Bcl-2的OD值比較差異有統計學意義(F=1 028.109，P<0.001)，組間兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.001)。

圖2　假手術組、IR+腎胺酶組、IR組SD大鼠腎組織的Bcl-2蛋白表達(IHC染色，×400)

2. Bax

假手術組可見少量Bax蛋白表達，IR+腎胺酶組的Bax陽性細胞比假手術組增多、比IR組減少，見圖3。假手術組、IR組、IR+腎胺酶組Bcl-2的OD值分別為23.6±3.5、112.5±8.4、52.5±5.7，3組Bax的OD值比較差異有統計學意義(F=641.083，P<0.001)，組間兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.001)。

圖3　假手術組、IR+腎胺酶組、IR組SD大鼠腎組織的Bax蛋白表達(IHC染色，×400)

三、3組SD大鼠的血清肌酐、血尿素氮水平比較

3組SD大鼠的血清肌酐、血尿素氮水平比較差異均有統計學意義(P均<0.001)，IR+腎胺酶組的血清肌酐、血尿素氮水平均比IR組降低(t分別為10.144、6.015，P均<0.001)，但均高于假手術組(t分別為11.258、8.088，P<0.001)，見表1。

表1假手術組、IR組、IR+腎胺酶組

注：與假手術組比較，aP<0.01；與IR組比較，bP<0.01

四、3組SD大鼠的血清丙二醛水平比較

假手術組、IR組、IR+腎胺酶組的血清丙二醛分別為(3.61±0.79)、(9.74±1.28)、(7.51±0.54) μmol/L，3組血清丙二醛水平比較差異有統計學意義(F=135.982，P<0.001)，IR組與IR+腎胺酶組血清丙二醛水平均高于假手術組(t分別為14.111、14.107，P均<0.001)；與IR+腎胺酶組相比，IR組血清MDA水平更高(t=5.561，P<0.01)。

討論

AKI是急性腎衰竭的早期階段，其病因多種多樣，病理生理機制尚未完全闡明[10]。其中腎臟IR-AKI在臨床上十分常見，預后不理想[11]。因此，積極尋求有效的AKI防治方法具有重要意義。目前認為，缺血、缺氧導致腎臟組織炎癥細胞浸潤，腎臟組織細胞凋亡、壞死和氧化應激損傷組織等參與了IR-AKI的病理生理過程[12]。

腎胺酶被發現已經有10余年，研究主要集中在心血管和慢性腎衰竭領域，其作用機制尚存在爭議[13-14]。最近研究發現，腎胺酶不僅在降低血壓、控制心率和抑制心肌肥厚等心血管疾病中扮演重要角色，還能對IRI的器官具有保護作用。Lee等[9]發現，腎胺酶能夠預防順鉑誘導的腎小管上皮細胞株HK-2損傷，炎癥因子表達明顯減少，在腎胺酶基因敲除小鼠中，不能耐受IRI。但是腎胺酶預防IR-AKI的作用機制尚未完全闡明。腎胺酶是作為單胺氧化酶降解循環中的兒茶酚胺改善缺血器官供血還是作為細胞因子與一種未知受體結合起作用，抑或存在其他未知機制尚存在爭議。

本研究建立SD大鼠IR-AKI模型后，SD大鼠血尿素氮和血清肌酐水平均比假手術組明顯升高，提示其腎功能下降，其腎臟形態學進一步表明建模成功。IR前予外源性人重組腎胺酶預處理，腎功能受損程度顯著減輕，腎小管損傷指數明顯下降，說明了腎胺酶能夠保護腎小管上皮細胞，減輕IR-AKI。

研究同時發現，IR+腎胺酶組的促凋亡蛋白Bax表達比IR組減少，抗凋亡蛋白Bcl-2表達比IR組表達增多。因此，腎胺酶可能是通過抑制凋亡蛋白表達和促進抗凋亡蛋白表達，從而保護腎小管上皮細胞免遭受IRI。

腎臟IR后會產生大量的自由基，自由基一方面直接參與對組織細胞損傷，另一方面自由基會作為第二信使參與細胞級聯反應[15]。自由基作用于脂質發生過氧化反應，終產物為丙二醛，丙二醛本身具有細胞毒性。因此丙二醛的水平能夠反映機體過氧化程度。IR+腎胺酶組的丙二醛水平明顯低于IR組，由此可見腎胺酶具有減少丙二醛生成，達到穩定細胞膜脂質成分，減少細胞毒性物質生成的作用，從而使IR后腎小管上皮細胞免受氧化應激產物的損傷。

IR-AKI是一個復雜的病理生理過程，本研究通過對IR-AKI大鼠模型予腎胺酶預處理，觀察氧化應激產物、凋亡蛋白及抗凋亡蛋白的水平，推測腎胺酶預防IR-AKI大鼠模型是通過減少氧化應激產物丙二醛、抑制凋亡蛋白和促進抗凋亡蛋白的表達，研究結果將為腎胺酶在AKI的防治應用提供依據。本研究尚有不足之處，如未從RNA及蛋白質等水平動態觀察表達情況，也沒有對上述各項指標行多個時間點觀測，腎胺酶還可能通過其他作用參與IR-AKI的保護機制等，日后我們將進一步深入研究以獲取更多可靠的證據。

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(本文編輯：林燕薇)

吳永東汪華林林蓉宇蔣強袁春玲

【摘要】目的探討腎胺酶在預防腎臟缺血再灌注(IR)致急性腎損傷(AKI)的作用及機制。方法選擇36只SD大鼠制作IR-AKI模型，隨機分成假手術組(僅游離出雙側腎蒂，不夾閉腎動脈)、空白對照組(IR組，缺血前30 min腹腔注射生理鹽水)、腎胺酶干預組(IR+腎胺酶組，缺血前20 min腹腔注射腎胺酶1 mg/kg)3組。于IR 18 h后，取腎臟組織行蘇木素-伊紅染色和免疫組織化學檢查，光鏡下觀察病理學改變，比較凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達水平；靜脈采血測血尿素氮、血清肌酐和丙二醛含量。結果IR+腎胺酶組的血清肌酐、血尿素氮和丙二醛水平和急性腎小管壞死指數均低于IR組(P均<0.01)、高于假手術組(P均<0.01)。IR+腎胺酶組的Bcl-2蛋白表達均高于IR組和假手術組(P<0.01)。IR+腎胺酶組的Bax蛋白表達低于IR組(P<0.01)、高于假手術組(P<0.01)。結論腎胺酶可減輕腎臟IR導致的AKI，其機制可能是通過抑制氧化應激產物的產生，并與上調Bcl-2抗凋亡蛋白和下調Bax促凋亡蛋白表達有關。

【關鍵詞】腎胺酶；缺血再灌注；急性腎損傷；氧化應激；凋亡

Mechanism of renalase in prevention of acute renal injury induced by ischemia and reperfusionWuYongdong,WangHualin,LinRongyu,JiangQiang,YuanChunling.DepartmentofNephropathy,theFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China

Correspondingauthor,WangHualin,E-mail:hualinwang@126.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of renalase in preventing acute kidney injury (AKI) induced by renal ischemia/reperfusion (IR). MethodsA total of 36 IR-AKI SD rat models were established and randomly divided into the sham-operated group (renal pedicle was separated without renal artery clipping), normal control (IR group, intraperitoneal injection of normal saline at 30 min before ischemia)group and renalase intervention group (IR+renalase group, intraperitoneal injection of 1.5mg/kg of renalase at 30 min before ischemia). At 18 h after IR, renal tissues were collected for H.E staining and immunohistochemical analysis and observed for pathological changes under light microscope. The expression levels of Bcl-2 and Bax were detected and statistically compared among three groups. The contents of serum creatinine, urea nitrogen and serum malonyldialdehyde were measured. ResultsThe levels of serum creatinine, urea nitrogen, serum malonyldialdehyde and acute tubular necrosis scoring index in the IR+ renalase group were significantly lower than those in the IR group (all P<0.01), whereas considerably higher compared with those in the shame-operated group (all P<0.01). The expression of Bcl-2 in the IR+renalase group was significantly higher compared with those in both the IR and shame groups (both P<0.01). The expression level of Bax in the IR+renalase group was significantly lower than that in the IR group (P<0.01) but dramatically higher compared with that in the sham-operated group (P<0.01). ConclusionsRenalase can alleviate IR-induced AKI probably by inhibiting the production of oxidative stress products, down-regulating the expression of of Bax and up-regulating the expression of Bcl-2.

【Key words】Renalase; Ischemia reperfusion; Acute kidney injury; Oxidative stress;Apoptosis

收稿日期：(2015-09-28)

通訊作者，汪華林，E-mail：hualinwang@126.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(30801140)

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.01.004