結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)對(duì)肺外結(jié)核診斷的臨床意義

田　洹，胡文斌，毛艷軍

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，甘肅蘭州 730020；2.甘肅中醫(yī)學(xué)院2013級(jí)碩士研究生，甘肅蘭州 730000)

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·臨床研究·

結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)對(duì)肺外結(jié)核診斷的臨床意義

田洹1，胡文斌2，毛艷軍1

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，甘肅蘭州 730020；2.甘肅中醫(yī)學(xué)院2013級(jí)碩士研究生，甘肅蘭州 730000)

摘要:目的評(píng)價(jià)結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-spot.TB試驗(yàn))對(duì)外周血中結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的臨床意義。方法對(duì)2014年5月至2015年5月在甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院治療的疑似結(jié)核病患者及體檢志愿者分成兩組，進(jìn)行對(duì)照研究，抽取外周靜脈血采用T-spot.TB診斷試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果肺外結(jié)核組陽(yáng)性者38例，陽(yáng)性率為95%(38/40)，陰性者2例，陰性率為5%(2/40)。健康對(duì)照組40例，陽(yáng)性者0例，陽(yáng)性率為0%(0/40)，陰性者40例，陰性率為100%(40/40)。靈敏度為95%(38/40)，特異度為100%(40/40)。肺外結(jié)核組陽(yáng)性率大于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論T-spot.TB試驗(yàn)對(duì)肺外結(jié)核有高度的敏感性和特異性，可以作為臨床判斷是否存在結(jié)核感染的檢測(cè)篩查手段之一，值得臨床推廣。

關(guān)鍵詞:結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)；肺外結(jié)核；臨床意義

結(jié)核病是危及人類健康的傳染病之一，我國(guó)是僅次于印度的第2結(jié)核大國(guó)，且近年有上升趨勢(shì)。結(jié)核分枝桿菌可侵犯全身各個(gè)系統(tǒng)，比較多見(jiàn)的有肺結(jié)核、骨結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎、淋巴結(jié)核、腸結(jié)核等，且肺外結(jié)核發(fā)病往往十分隱匿，給臨床的診斷和治療帶來(lái)了極大的困難。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法存在許多不足，隨著基因分子生物學(xué)的發(fā)展，更好的檢測(cè)手段應(yīng)運(yùn)而生，結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)是檢測(cè)結(jié)核感染的最新方法。T-spot.TB使用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞因子γ-干擾素的分泌檢測(cè)抗原特異性T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)，從而判斷結(jié)核感染的狀態(tài)，具有良好的敏感性和特異性。現(xiàn)對(duì)在本院治療的肺外結(jié)核感染患者與體檢的健康志愿者進(jìn)行對(duì)照研究，擬探討T-spot.TB試驗(yàn)對(duì)肺外結(jié)核診斷的臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料A組(肺外結(jié)核組)：選取2014年5月至2015年5月在甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院治療的肺外結(jié)核患者共40例，年齡18～80歲，平均43.3歲，所有患者均進(jìn)行影像學(xué)檢查及結(jié)核免疫學(xué)檢查，疑似結(jié)核，其中淋巴結(jié)核14例、結(jié)核性胸膜炎9例、腰椎結(jié)核8例、結(jié)核性腹膜炎7例、支氣管結(jié)核2例。B組(健康對(duì)照組)選取在本院體檢的健康志愿者40例，健康組均無(wú)陳舊性結(jié)核，亦進(jìn)行影像學(xué)檢查及結(jié)核免疫學(xué)檢查，排除感染結(jié)核。整個(gè)過(guò)程由專門(mén)經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的人員負(fù)責(zé)完成并控制質(zhì)量。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑T-SPOT.TB試劑盒由上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司提供。

1.3方法

1.3.1淋巴細(xì)胞的提取、計(jì)數(shù)及鋪板抽取肝素鈉抗凝靜脈血5 mL，顛倒混勻，再加入1640至滿，混勻備用。于每支15 mL無(wú)菌離心管中加入3 mL淋巴細(xì)胞分離液，將混勻的全血緩慢加入淋巴分離液上層約10 mL，離心機(jī)剎車檔調(diào)至2檔，離心速度2 400 r/min 離心22 min，用一次性吸管吸取白膜層至另一離心管中，加1640至10 mL，顛倒混勻2次，再次以1 800 r/min離心7 min，去掉上清液，手工拍打沉淀，再加入1640至10 mL，最后一次以1 400 r/min離心7 min，倒掉上清液，每管加入600 μL AIM-V培養(yǎng)液，用槍吹勻細(xì)胞沉淀，取200 μL加入EP管中進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)(測(cè)得白細(xì)胞數(shù)-2.5)×200，稀釋所有標(biāo)本數(shù)至每毫升2.5×106個(gè)(每毫升低于2.5×106個(gè)可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果)，按照計(jì)算數(shù)值加入AIM-V培養(yǎng)液至各標(biāo)本管中，稀釋后即可進(jìn)行鋪板，每人份4孔，分別加入50 μL陽(yáng)性對(duì)照、A抗原、B抗原和陰性對(duì)照，再加入100 μL稀釋混勻的細(xì)胞懸液，混勻后放入二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～22 h。

1.3.2顯色按照每人份8 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)用量將PBS 10倍濃縮液用蒸餾水稀釋，用配好的PBS應(yīng)用液稀釋酶標(biāo)二抗抗體，每人份1 μL酶標(biāo)二抗抗體，200倍稀釋配成工作液。將培養(yǎng)板從CO2培養(yǎng)箱內(nèi)取出，甩掉孔內(nèi)液體，每孔用PBS洗滌4遍，拍干，每孔加入50 μL酶標(biāo)二抗抗體工作液，放置4～8 ℃冰箱內(nèi)孵育1 h，取出后用PBS洗滌4遍，拍干，每孔加入50 μL顯色液，CO2培養(yǎng)箱放置5～7 min，出現(xiàn)清晰斑點(diǎn)后用蒸餾水沖洗4遍，拍干，風(fēng)干5～10 min。

1.4結(jié)果的判斷

1.4.1陽(yáng)性結(jié)果(1)空白對(duì)照孔數(shù)為0～5個(gè)時(shí)且抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù)減法空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)大于或等于6；(2)空白對(duì)照孔數(shù)為6～10個(gè)時(shí)且(抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù)≥2)×(空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù))。

1.4.2陰性結(jié)果不符合上述陽(yáng)性結(jié)果且PHA對(duì)照孔正常則結(jié)果為陰性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理檢驗(yàn)結(jié)果用例數(shù)或百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)方法，應(yīng)用SPSS21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

肺外結(jié)核組陽(yáng)性者為38例，陽(yáng)性率為95%(38/40)，陰性者為2例，陰性率為5%(2/40)。健康對(duì)照組40例，陽(yáng)性者為0例，陽(yáng)性率為0%(0/40)，陰性者為40例，陰性率為100%(40/40)。靈敏度為95%(38/40)，特異度為100%(40/40)。肺外結(jié)核組T細(xì)胞反應(yīng)陽(yáng)性率大于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1　　結(jié)核分枝桿菌抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)頻率

3討論

世界衛(wèi)生組織2004年的報(bào)告顯示，結(jié)核病診斷率僅為37%，即使在發(fā)達(dá)國(guó)家也僅有50%的結(jié)核病例得到細(xì)菌學(xué)確診[1]，而肺外結(jié)核病變部位多變、癥狀不典型，相對(duì)于肺結(jié)核診斷難度又更大。目前，臨床診斷結(jié)核的方法存在許多不足，如：結(jié)核菌素試驗(yàn)一直是診斷結(jié)核菌感染的重要方法，具有操作簡(jiǎn)單，成本低廉的優(yōu)勢(shì)，但存在特異性及敏感性較低的缺陷，在結(jié)核感染免疫力低下人群中，其敏感性降低。由于結(jié)核菌素純蛋白的衍生物(PPD)是200多種蛋白的混合物，其中很多是非結(jié)核分枝桿菌(BCG)的共同抗原成分，在普通接種BCG的地區(qū)造成非常高的假陽(yáng)性。而其他檢測(cè)方法如細(xì)菌學(xué)檢查作為診斷結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，其細(xì)菌培養(yǎng)費(fèi)時(shí)長(zhǎng)一般需要2個(gè)月，可能延誤治療的最佳時(shí)間；抗酸染色試驗(yàn)檢出率較低；組織病理學(xué)為有創(chuàng)傷性操作；影像學(xué)診斷缺乏特異性。隨著基因分子生物學(xué)的研究發(fā)展，發(fā)現(xiàn)機(jī)體受到結(jié)核分枝桿菌感染后，引發(fā)固有免疫和獲得性免疫，由于機(jī)體長(zhǎng)期存在特異性的中央型及效應(yīng)型記憶細(xì)胞，當(dāng)抗原刺激機(jī)體時(shí)，這些記憶迅速活化增殖并釋放γ-干擾素。因此，通過(guò)某種技術(shù)檢測(cè)機(jī)體內(nèi)經(jīng)結(jié)核刺激后釋放γ-干擾素的數(shù)量，即可推斷出是否存在結(jié)核分枝桿菌感染。而T-spot.TB試驗(yàn)是檢測(cè)結(jié)核感染的最新方法，它可以檢測(cè)出1/100 000～1/50 000的外周血中單核細(xì)胞中經(jīng)抗原刺激后釋放細(xì)胞因子的細(xì)胞，目前已成為最敏感的檢測(cè)方法[2]。大量研究表明T-spot.TB試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)肺外結(jié)核感染具有較高的敏感性和特異性。如Kim等[3]對(duì)疑似肺外結(jié)核患者72例進(jìn)行前瞻性研究，結(jié)果T-spot.TB檢測(cè)對(duì)肺外結(jié)核的敏感性為94%，明顯高于結(jié)核菌素試驗(yàn)(47%)，其中47例有免疫抑制性疾病，這也是結(jié)核菌素試驗(yàn)陽(yáng)性較低的原因之一。Dai等[4]Meta分析結(jié)果提示T-spot.TB試驗(yàn)敏感性和特異性分別為88%和89%。王永生等[5]對(duì)其醫(yī)院26例疑似結(jié)核性腦膜炎與23例無(wú)結(jié)核原發(fā)病灶的腦膜炎患者做腦脊液T-spot.TB試驗(yàn)檢查，進(jìn)行對(duì)照研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其靈敏度為88.5%，特異度為83.3%，對(duì)診斷結(jié)核性腦膜炎有用。榮蘭香等[6]對(duì)其醫(yī)院268例疑似結(jié)核病患者進(jìn)行T-spot.TB試驗(yàn)和PPD試驗(yàn)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T-spot.TB試驗(yàn)比結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)試驗(yàn)的敏感性和特異性要高，且假陽(yáng)性率和假陰性率要低，可為臨床診斷結(jié)核病患者提供早期診斷依據(jù)。聶力平等[7]比較了T-spot.TB試驗(yàn)與結(jié)核菌素試驗(yàn)兩種檢測(cè)法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T-spot.TB試驗(yàn)的靈敏度和特異度高于結(jié)核菌素試驗(yàn)，且假陽(yáng)性率和假陰性率低于結(jié)核菌素試驗(yàn)。劉珍瓊等[8]研究發(fā)現(xiàn)用T-spot.TB試驗(yàn)檢測(cè)外周血和胸腔積液中單個(gè)核細(xì)胞結(jié)核桿菌感染有助于提高結(jié)核性胸膜炎的診斷率．而且胸腔積液中單個(gè)核細(xì)胞T-spot.TB試驗(yàn)敏感性和特異性高于外周血。采用T-spot.TB試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)核性心包積液、結(jié)核性腹膜炎、結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性腹水、脊柱結(jié)核、腸結(jié)核、腎結(jié)核都有相關(guān)報(bào)道且檢測(cè)結(jié)果較好，特異度和靈敏度皆比其他結(jié)核桿菌檢測(cè)方法要高。

本次研究結(jié)果表明T-spot.TB對(duì)肺外結(jié)核的診斷，其靈敏度為95%，特異度為100%。其中肺外結(jié)核組有2例檢測(cè)為陰性，考慮可能與患者抗結(jié)核治療效果有關(guān)，也有可能與個(gè)別體質(zhì)有關(guān)，也可能確實(shí)未有結(jié)核感染。健康對(duì)照組選擇的是沒(méi)有結(jié)核病史或接觸史的研究對(duì)象，檢測(cè)結(jié)果全部陰性，說(shuō)明T-spot.TB試驗(yàn)對(duì)肺外結(jié)核檢測(cè)結(jié)果是肯定的，也有可能與這次試驗(yàn)的樣本量較小有關(guān)。本次T-spot.TB試驗(yàn)采外周靜脈血檢查，只能檢測(cè)出是否有結(jié)核桿菌的存在，并不能定位結(jié)核病灶。在痰結(jié)核菌檢測(cè)陰性、胸部CT診斷陰性病例中診斷意義較大[9]。所以當(dāng)采血做T-spot.TB試驗(yàn)檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性者，再結(jié)合X線片、CT或痰培養(yǎng)檢查，即可基本確定感染結(jié)核病灶的位置了。由此可見(jiàn)T-spot.TB試驗(yàn)靜脈采血檢查可用于職業(yè)暴露合并結(jié)核病的定期檢測(cè)篩查，可作為臨床判斷是否存在結(jié)核感染的檢測(cè)篩查手段之一。有利于更好地用于肺外結(jié)核的輔助診斷。所以，T-spot.TB檢測(cè)對(duì)肺外結(jié)核具有重要的臨床意義，值得臨床推廣。

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(收稿日期：2015-07-12)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.01.054

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)01-0114-02