模擬加速度對腎草酸鈣結石模型大鼠氧化應激的影響

陳凱凱,郭和清,穆大為,李建業,嚴景民,尹杏林,張立銘

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·論著·

模擬加速度對腎草酸鈣結石模型大鼠氧化應激的影響

陳凱凱,郭和清,穆大為,李建業,嚴景民,尹杏林,張立銘

[摘要]目的探討加速度暴露對腎草酸鈣結石模型大鼠氧化應激的影響。方法采用乙二醇飲水和氯化銨灌胃法誘導建立大鼠草酸鈣結石模型，將40只8周齡Wistar健康雄性大鼠隨機分為4組(每組10只)：空白對照組(A組)、單純誘石組(B組)、加速度并誘石組(C組)和單純加速度組(D組)。其中A組采用自來水飲水+生理鹽水2 mL/d灌胃，B組采用1%乙二醇+2%氯化銨溶液2 mL/d灌胃，C組在B組的基礎上給予加速度(+6G)暴露，D組單純給予+6G暴露。各組大鼠在相同條件下飼養28 d后收集血液及雙腎標本，左腎組織做石蠟切片HE染色，光鏡下觀察草酸鈣結晶情況；右腎組織制成組織勻漿，測定血液和右腎組織勻漿中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、還原性谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量，以了解氧化應激情況。結果單純誘石組和加速度并誘石組腎組織草酸鈣結晶評分較空白對照組和單純加速度組均顯著增高(P<0.01)，加速度并誘石組結晶評分亦較單純誘石組增高(P<0.01)。單純誘石組和加速度并誘石組與空白對照組比較，大鼠血、腎組織MDA濃度顯著升高(P<0.01)，血、腎組織SOD、CAT、GSH-Px濃度顯著降低(P<0.01)。結論加速度暴露可能是泌尿系結石形成的危險因素之一，其機制可能與加速度暴露引起大鼠腎臟組織氧化應激損傷有關。

[關鍵詞]腎結石；草酸鈣；加速度；氧化應激；大鼠

作者單位：100142北京，北京空軍總醫院泌尿外科

引用格式：陳凱凱,郭和清,穆大為,等.模擬加速度對腎草酸鈣結石模型大鼠氧化應激的影響[J].東南國防醫藥，2016,18(1):10-12，31.

泌尿系結石是飛行人員常見疾病，病因復雜，絕大多數患者無明顯解剖及生理異常，主要表現為上尿路結石，患病率達2.6%~7.8%[1]。在因泌尿系統疾病住院的飛行員中，泌尿系結石所占比例高達70%左右[2]。主要原因考慮與患者飲食結構和自身職業特點有關，如長期攝入高蛋白、高嘌呤、高蔗糖及高鈣膳食，長時間飛行時出汗，尿中結晶鹽經常處于過飽和狀態，均可促進泌尿系結石的形成[3-4]。有研究證實加速度暴露可誘導氧化應激從而引起腎小管上皮細胞氧化損傷[5]，而腎小管上皮細胞損傷是腎結石發生發展的重要環節[6]，但是關于加速度暴露是否是腎結石形成的危險因素，國內研究較少，本實驗擬通過研究加速度對大鼠氧化應激及腎草酸鈣結石形成的影響，為臨床防治飛行員泌尿系結石提供理論探討。

1材料與方法

1.1實驗材料SPF級健康成年雄性Wister大鼠40只，體重180～220 g，由解放軍304醫院實驗動物中心提供[批準文號：SYXK(軍)2012-0014；合格證號：No.11401500002634]；小動物專用離心機(長春奧普光電公司，中國)由航空醫學研究所提供；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、還原性谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；1%乙二醇、2%氯化銨(生產批號：130105)購自西隴化學股份有限公司。

1.2實驗方法本實驗經院動物倫理委員會批準，大鼠的使用符合動物保護相關倫理條例。所有大鼠自由攝取食物、水，在25 ℃空調恒溫、12 h白晝循環環境下適應性飼養1周后，按隨機分組法分為4組，每組10只，從第2周開始施加不同干預因素繼續飼養4周。參考文獻[7]復制腎草酸鈣結石模型：空白對照組(A組)，自來水飲水+生理鹽水2 mL/d灌胃；單純誘石組(B組)，1%乙二醇+2%氯化銨2 mL/d灌胃；加速度并誘石組(C組)，在B組的基礎上給予加速度干預，使用小動物離心機在加速度(+6G)下暴露1 min，5次/d，每次中間休息5 min，每周3次，共4周；單純加速度組(D組)，自來水飲水+生理鹽水2 mL/d灌胃，加速度干預同C組。

1.3觀測指標實驗進行至第4周末，斷頸處死大鼠，下腔靜脈穿刺取血，迅速取出雙腎。右腎使用組織勻漿器制成10%組織勻漿待測氧化應激指標；左腎用4%甲醛固定，石蠟切片，常規蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察腎組織草酸鈣結晶及病理改變情況。光鏡觀察左腎常規切片成石情況根據結晶的分布區域及結晶形成程度的雙重因素進行評分[8]。結晶情況以積分值來評價，積分值[8]由結晶分布區域的分值與結晶形成程度的分值相乘得到，即：結晶分布區域以腎皮質內結晶為1分，腎皮質及腎髓質內結晶為2分，腎皮質、腎髓質、腎乳頭內均有結晶為3分，腎皮質、腎髓質、腎乳頭及腎盂內均有結晶為4分；結晶形成程度以無為0分，極少為1分，較多為2分，廣泛形成為3分。

按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書，測定腎組織勻漿中MDA、SOD、GSH、GSH-Px及CAT含量。

2結果

2.1各組大鼠腎組織切片草酸鈣結晶情況A組:腎組織無結晶形成，腎乳頭、腎盂、腎盞結構清晰，細胞排列整齊、規則，腎小管腔內無壞死脫落樣物質；B組:腎組織部分可見皮質或及髓質或及腎乳頭少量或較多結晶，形狀不規則、折光性較強，少量炎細胞浸潤，上皮細胞有時可見腫脹，間質有少量水腫；C組大鼠: 腎組織皮質、髓質、腎乳頭皆可見大量無色透明草酸鈣結晶形成，大部分腎組織切片內可見結石結晶，切片各部分均可見大量炎細胞浸潤，腎小管上皮細胞腫脹；D組大鼠：腎組織無結晶形成，腎乳頭、腎盂、腎盞結構清晰，腎小球形狀較規則，少量炎細胞浸潤，腎小管有時可見擴張，上皮細胞有時可見腫脹，間質有少量水腫(圖1)。B組、C組腎組織草酸鈣結晶評分(分別為7.1±2.9、10.3±3.6)比A組、D組(均為0±0)顯著增高(P<0.01)，C組結晶評分亦較B組顯著升高(P<0.01)。

2.2各組大鼠血、腎組織勻漿MDA等的比較與A組比較，B、C、D組大鼠血、腎組織MDA濃度顯著增加(表1，P<0.01)，加速度干預(C、D組)可增加血、腎組織MDA。與A組比較，B、C、D組大鼠血、腎組織SOD、GSH-Px、CAT濃度顯著降低(P<0.01)，且C組0.05)。

3討論

圖1　光鏡下各組大鼠腎組織草酸鈣結晶(箭頭所示)情況 (HE ×400)

表1　各組大鼠血、腎勻漿組織MDA和SOD等的比較±s)

項目A組(n=10)B組(n=10)C組(n=10)D組(n=10)血MDA(nmol/mL)20.35±2.3536.92±3.23#43.22±3.52#27.95±1.87#腎勻漿MDA(nmol/mgpr)8.67±0.8412.43±0.96#15.33±0.71#10.63±0.79#血SOD(U/mL)115.45±18.3775.99±15.55#53.67±12.35#93.98±17.35#腎勻漿SOD(U/mgpr)324.36±26.67198.71±32.32#116.85±18.25#246.11±26.58#血CAT(U/mL)6.64±0.694.32±0.46#3.32±0.41#5.38±0.62#腎勻漿CAT(U/mgpr)138.47±8.74129.87±9.55#118.95±6.35#133.49±7.45#血GSH-Px(U/mL)26.84±2.8621.06±3.61#15.33±4.56#24.73±3.54#腎勻漿GSH-Px(U/mLpr)46.28±3.4733.63±4.63#37.62±2.97#38.94±3.99#血GSH(nmol/mL)38.98±4.5526.87±3.92#23.72±3.24#25.33±2.53#腎勻漿GSH(nmol/mLpr)122.33±12.5489.72±9.93#83.95±8.54#88.81±9.33# 注:與A組比較,﹟P<0.01

為研究加速度暴露因素對大鼠腎草酸鈣結石的影響及其發生機制，我們采用乙二醇飲水和氯化銨灌胃法誘導建立了大鼠腎草酸鈣結石模型[7]。乙二醇是草酸代謝的間接前體，在體內經過羥乙酸途徑代謝產生草酸，是目前復制腎草酸鈣模型最常用的基礎誘石劑，常與腎毒性藥物氯化銨聯用加快腎結石的形成，提高造模成功率。本實驗中大鼠飲用1%乙二醇溶液和2%氯化銨溶液灌胃后腎小管內出現了結石結晶，說明造模成功，與國內外有關作者[7-8]報道一致。其中C組草酸鈣結晶評分高于B組，說明大鼠暴露于加速度下促進了腎小管內草酸鈣結晶量的增加。

加速度暴露促進腎結石的形成可能與腎臟氧化應激損傷有關。正常情況下，機體存在著氧自由基的產生與清除酶系統之間的動態平衡，一旦這種平衡遭到破壞即可造成細胞的損傷而致病。氧自由基不僅能直接損傷腎小管上皮細胞，還能引起脂質過氧化產物的增多，導致機體內氧化與抗氧化系統失衡，繼而在各種大分子的作用下觸發級聯反應促進腎結石的最終形成[9]。Khan等[10]研究認為腎小管管腔壁可能是草酸鈣結石最初成核部位，草酸鈣結晶體附著并生長依賴于腎小管上皮細胞的損傷。草酸鈣會刺激腎小管上皮細胞產生活性氧簇ROS引起氧化應激反應，導致上皮細胞自身損傷進而產生帶負電荷的物質如磷脂酰絲氨酸等并成為附著點，草酸鈣即以此為中心進行黏附并生長[11]。腎小管上皮細胞損傷后還可以導致其能夠抑制晶體結晶過程的物質生成減少，從而有利于腎結石的形成。

持續性加速度作用是航空航天飛行活動中的常見現象，隨著新型戰斗機的大量服役，這一問題將更加突出。在加速度作用下，隨著流體靜壓梯度的增加，器官的動脈血壓降低，血流量下降到臨界值以下時，組織發生急性缺血缺氧[12]，血液轉移及血液動力學改變所引起的機體變化類似“缺血再灌注”的影響。組織缺血再灌注以及強烈的應激反應等均可引起機體氧自由基代謝異常[13]，從而引起腎結石的發生發展。MDA水平可反映機體內脂質過氧化的程度，而SOD是在機體活性氧清除反應過程中發揮重要作用的抗氧化酶[14]。本實驗大鼠暴露于加速度后，血和腎組織MDA較對照組顯著升高(P<0.01),血、腎組織SOD、GSH-Px、CAT濃度顯著降低(P<0.01)，驗證了加速度暴露不僅能直接導致氧自由基的產生，還能降低腎臟的SOD和CAT的活性，從而升高腎組織中氧自由基的水平，顯著增加的氧自由基具有直接的細胞毒性而致腎損傷，并促進腎結石的發生及發展

綜上所述，加速度暴露會促進腎小管內草酸結晶量的增加，其機制可能與加速度作用引起腎臟氧化應激損傷有關，建議臨床上對暴露于持續性加速度的飛行人員采取相關防護措施。以上結論是在大鼠實驗結果基礎上的推測，飛行人員經受加速度暴露環境后，相關指標變化趨勢是否與實驗結果一致，還應進行進一步研究證實。

【參考文獻】

[1]鄭杰,郭和清,潘廣新,等．缺氧或+Gz暴露對大鼠腎結石形成影響的實驗研究[J]．中華航空航天醫學雜志,2012，23(2)：98-101．

[2]劉永勝,郭和清,汪澤厚,等．1991～2007年泌尿外科飛行員住院疾病譜分析[J]．空軍總醫院學報,2009，25(3)：134．

[3]金磊,徐斌先,向軍吉,等.駐蘇某飛行部隊泌尿系結石相關因素調查和分析[J]．東南國防醫藥,2014,16(5):529-530.

[4]孫斌,郭和清,李建業,等．飛行員腎臟小結石帶石飛行初步觀察[J]．中華航空航天醫學雜志,2013,24(1):40-42.

[5]魏日胞,王永新,詹皓,等. 復方天葡片對高+Gz應激致大鼠腎損傷的保護作用[J]. 中國中西醫結合腎病雜志,2012,13(3):206-209.

[6]Hirose M,Yasui T,Okada A,et al．Renal tubular epithelial cell injury and oxidative stress induce calcium oxalate crystal formation in mouse kidney[J]．Int J Urol,2010,17(1):83-92．

[7]Touhami M, Laroubi A, Elhabazi K，et al. Lemon juice has protective activity in a rat urolithiasis model[J]. BMC Urol,2007,7:18.

[8]向松濤,甘澍周,建甫,等. 廣金錢草水提取液對腎草酸鈣結石模型大鼠氧化應激的影響研究[J]．中華泌尿外科雜志,2014,35(6):465-468.

[9]Davaios M,Konno S,Eshghi M, et a1．Oxidative renal cell injury induced by calcium oxalate crystal and renoprotection with antioxidants：a possible role of oxidative stress in nephrolithiasis[J]．J Endourol,2010,24(3):339-345．

[10]Khan SR．Calcium oxalate crystal interaction with renal tubular epithelium, mechanism of crystal adhesion and its impact on stone development[J]．Urol Res,1995,23(2):71-79．

[11]Khan SR．Renal tubular damage/dysfunction: key to the formation of kidney stones[J]. Urol Res,2006,34(2):86-91.

[12]劉建彬,王洪波,劉麗,等. 離心機訓練對大鼠腦及其它組織IL-6和TNF-a基因表達水平的影響[J].中國生物化學與分子生物學報,2002,18(5):649-653.

[13]馬良,胡敏,孫振宇,等.持續性高正加速度重復作用導致大鼠損傷的自然修復模型[J]. 軍醫進修學院學報,2005,26(6):401-403.

[14]蔡輝,趙凌杰,董曉蕾,等.吡格列酮對高脂血癥大鼠SOD活性和MDA水平的影響[J].東南國防醫藥,2011,13(2):97-99.

(本文編輯：張仲書；英文編輯：王建東)

Effect of acceleration on oxidative stress of renal calcium oxalate rat models

CHENKai-kai,GUOHe-qing,MUDa-wei

,LIJian-ye,YANJing-min,YINXing-lin,ZHANGLi-ming.DepartmentofUrology,AirForcePLAGeneralHospital,Beijing100142,China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of accelerationon on oxidative stress of renal calcium oxalate (CaOx) rat models. MethodsThe models of renal CaOx were established with Ethylene Glycol(EG) in drinking water and Ammonium Chloride(AC) by gavage. A total of 40 adult healthy male Wistar rats were randomly and averagely divided into 4 groups(10 of each): blank control group(A), stone forming group(B), stone forming with +6G exposure group(C) and +6G exposure naive group(D). Group A was established with drinking water and physiological saline by gavage (2 mL per day). Group B was established with 1% ethylene glycol in drinking water and 2% ammonium chloride by garage(2 mL per day). Group C, with the foundation of group B, was exposed in+6G. Group D was exposed in +6G as same as group C. After feeding for 28 days, blood and renal samples were collected. The presence of CaOx crystals was scored in left renals under hematoxylin and eosin staining, and the level of malonddialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione (GSH) and glutathione Peroxidase (GSH) in the blood and right renal homogenate were measured as indicators of oxidative stress. ResultsFor the formation of CaOx crystals, the score of group B and group C were significantly higher than group A and group D(P<0.01), and the score of group C were significantly higher than group B(P<0.01). For the parameter of oxidative stress, compared with group A, the concentration of MDA in blood and kidney tissues of group B significantly increased (P<0.01),which significantly increased (P<0.01) after the intervention of +6G (group C). Compared with group A, the content of SOD, CAT and GSH-Px in blood and kidney tissues of group B significantly decreased (P<0.01), which significantly increased (P<0.01) after the intervention of +6G (group C). ConclusionAcceleration would be one of the risk factor contributed to kidney stone formation. The mechanism is connected with the oxidative damage of renal tissue．

[Key words]kidney calculi; calciumoxalate; acceleration; oxidative stress; rats

(收稿日期：2015-10-18；修回日期：2015-11-22)

通訊作者：郭和清，E-mail：guoheqing@sina.com

基金項目：全軍后勤科研“十二五”重大項目(AKJ11J004)

[中圖分類號]R852

[文獻標志碼]A

doi：10.3969/j.issn.1672-271X.2016.01.003