早期糖尿病大鼠視網膜Notch-1表達變化的初步研究

高娜

·實驗研究·

早期糖尿病大鼠視網膜Notch-1表達變化的初步研究

高娜

目的 研究發現Notch受體與其Delta樣配體4的信號通路參與糖尿病視網膜病變病程進展,但其信號通路在糖尿病視網膜具體作用并未得到具體研究。故本次研究SD大鼠糖尿病模型早期視網膜內Notch-1表達變化。方法 2月齡雄性SD大鼠40只,隨機分為4組(對照1月組,對照2月組,糖尿病1月組,糖尿病2月組),糖尿病(diabetes mellitus,DM)模型組均予以60mg/Kg體重鏈脲佐菌素(STZ,streptozocin)腹腔注射,造模成功后對比模型組和對照1月以及2月組視網膜內Notch-1 受體表達變化。結果 免疫組化結果顯示Notch-1在大鼠視網膜神經節細胞層分布最為集中,且比正常對照組表達明顯增強。免疫印跡結果顯示DM 1月和2月組Notch-1蛋白表達均明顯高于對應正常對照組,但DM 1月和2 月組間未見顯著差異。結論 早期糖尿病大鼠視網膜神經節細胞層Notch-1表達明顯增強,其在糖尿病視網膜病變可能有著重要的干預作用。

糖尿?。?糖尿病視網膜病變； Notch-1

目前,Delta-Notch信號通路被認為是調節新生血管發生的另一個重要機制,VEGF和Delta-Notch信號通路在多方面相互作用[1],在腫瘤血管的研究中發現聯合抑制VEGF和Delta-Notch號通路可協同抑制腫瘤生長[2]。DII4/Notch信號通路有望成為針對新生血管的又一新靶點,而新生血管作為糖尿病視網膜病變最嚴重的并發癥,此信號通路的研究將為糖尿病視網膜病變的治療提供新方向。所以本次實驗初步研究早期糖尿病SD大鼠模型Notch-1信號通路改變,為臨床治療提供理論依據。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗材料

清潔級2月齡雄性SD大鼠40只(成都中醫藥大學實驗動物中心提供),體重200～250克。實驗動物均適應性喂養一周,予以自由飲食和飲水,室內溫度為24±3°C,相對濕度為50±15%,其余按照實驗室飼養標準進行。實驗材料及設備主要包括：STZ,十二烷基磺酸鈉、過硫酸銨、四甲基二乙胺、甘氨酸、Tris-base(美國Sigma)；檸檬酸緩沖液,免疫組化試劑盒 (武漢博士德),血糖儀及試紙(美國強生)；HRP標記二抗羊抗兔,Notch 兔抗大鼠抗體(美國Santa Cruz ),ECL發光液 (Thermo scientific)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS上樣緩沖液液體(5X)(北京碧云天)；電泳儀電源,垂直電泳儀,垂直轉膜儀(美國bio-rad)；高速低溫離心機 (Thermo scientific)。

1.2 實驗方法

SD大鼠(200～250g)禁食12h,腹腔注射60 mg STZ后(對照組注射生理鹽水),自由飲食,72小時后再次測空腹血糖,血糖濃度超過13.8mmol/L認為造模成功,自由飲食1月,每周剪尾測空腹血糖一次,剔除血糖低于13.8mol/L大鼠。1月組和2月組均在相應時間予以3%戊巴比妥鈉 30mg/Kg麻醉,摘除一側眼球后顯微鏡下取出視網膜至于液氮中,隨后右心灌注PBS后繼續灌注4%多聚甲醛,取眼球后4%多聚甲醛進行固定,后期行視網膜切片。視網膜切片石蠟包埋后視神經標識切片,厚度為5μm,貼片脫蠟復水后檸檬酸緩沖液抗原修復,Notch-1 兔抗大鼠抗體(1:50) 4℃孵育過夜,PBS沖洗后羊抗兔1:500室溫孵育1h,DAB顯色,鏡下觀察拍照。視網膜免疫印跡主要步驟為視網膜組織裂解勻漿,BCA法檢測蛋白含量,按比例加入SDS-PAGE上樣緩沖液,95℃充分變性后-20℃保存。7.5%分離膠,5%濃縮膠,每孔上20微升細胞裂解上樣液,邊孔加入5微升預染Marker,80V電泳,100mA低溫轉膜。轉膜后5%脫脂奶粉室溫封閉1h,Notch-1 兔抗大鼠抗體(1:500)室溫下孵育2h,或者予以β-actin內參室溫孵育2h,其后予以HRP標記二抗羊抗兔(1:3000)室溫孵育1h,TBST再次洗膜,ECL發光,X光片中曝光。Gel-pro analyze 4.5凝膠分析系統檢測目的條帶及內參IOD值,每次分別測量3次后記錄兩者比值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23．0軟件進行統計學分析,免疫印跡IOD平均值±S表示。組間比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 免疫組化切片結果

本次實驗各組免疫組化切片DAB染色結果圖1至圖4,圖中可見Notch-1免疫組織化學染色陽性表達主要集中在神經節細胞層。與正常對照組 Control 1M 和Control 2M比較,糖尿模型組DM 1M 和DM 2M 組的視網膜神經節細胞層Notch-1陽性表達明顯增強,DM 1M組和DM 2M組之間比較Notch-1表達略顯增強。

圖1 Control 1M Notch-l免疫組織化學染色結果(400×)

圖2 Control 2M Notch-l免疫組織化學染色結果(400×)

圖3 DM 1M Notch-l免疫組織化學染色結果(400×)

圖4 DM 2M Notch-l免疫組織化學染色結果(400×)

2.2 免疫印跡結果

由圖5可見Western blot條帶經Gel-pro analyze 4.5分析顯示糖尿病1月組和2月組Notch-1表達均明顯高于正常組(P=0.003),但糖尿病1,2月組Notch-1表達無明顯差異(P=0.56)。

圖5 Western blot 結果圖注Control 1M 為正常對照1月組,Control 2M 為正常對照2組,DM 1M 為糖尿病1月組,DM 2M 為糖尿病2月組,Beta-actin為內參,*為與Control 1M 和2M 比較差異有統計學意義(P=0.003),#為與DM 1M組比較,差異無統計學意義(P=0.56)

3 討論

因血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在臨床所帶來的良好的治療效果,所以大量研究幾乎全部集中與與血管生成相關細胞因子的信號通路。但是臨床發現,仍有部分病例使用抗VEGF后不能完全阻斷視網膜新生血管的形成,另外還存在藥物有效作用時間短、局部及全身副作用等問題,導致患者使用抗VEGF藥物后療效不佳[3-5]。近期研究發現Notch信號通路與各類型腫瘤發生發展有密切的聯系,腫瘤細胞內有大量表達的Notch受體和配體,Notch信號通路的激活對于腫瘤的血管形成也有重要意義[1,6],所以Notch受體與配體的研究也成為抑制視網膜新生血管化的新的熱點。糖尿環境下VEGF表達升高機理類似,Notch-1表達增加也與缺氧、氧化應激等有關[7]。另外研究也發現抑制Notch-1表達也能抑制VEGF表達升高所導致的糖尿病腎臟損害[8]。

本次研究雖然只是對早期糖尿病大鼠視網膜中Notch-1表達變化進行了簡單研究,但發現正常對照組與糖尿病模型組的視網膜神經節細胞層見到陽性表達,且隨糖尿病造模時間延長Notch-1表達有不斷增加的趨勢。本次研究同時發現Notch-1受體表達最為集中的在視網膜神經節細胞層,推斷糖尿病早期對于眼部的損害最先損傷的也應該是視網膜神經節細胞層,所以下一步研究的主要是針對其對應配體Delta-like ligand 4在視網膜內層變化的研究。

[1] Li JL,Harris AL.Crosstalk of VEGF and Notch pathway in tumor angiogenesis:therapeutic implications.Front Biosci,2009,14(1):3094-3110.

[2] Bray SJ.Notch signalling:a simple pathway becomes complex.Nat Rev Mol Cell Biol,2006,7(9):678-689.

[3] Boyer DS,Hopkins JJ,Sorof J,Ehrlich JS.Anti-vascular endothelial growth factor therapy for diabetic macular edema.[J].Ther Adv Endocrinol Metab,2013,4:151-169.

[4] Falavarjani KG,Nguyen QD.Adverse events and complications associated with intravitreous injection of anti-VEGF agents:a review of literature.[J].Eye (Lond),2013,27:787-794.

[5] Cheung N,Wong IY,Wong TY.Ocular anti-VEGF therapy for diabetic retinopathy:overview of clinical efficacy and evolving applications[J].Diabetes Care,2014,37:900-905.

[6] Segarra M,et al.Dll4 activation of Notch signaling reduces tumor vascularity and inhibits tumor growth[J].Blood 2008,112:1904-1911.

[7] Yoon CH,Choi YE,Kohd SJ,et al．High glucose-induced jagged 1 in endothelial cells disturbs notch signaling for angiogenesis：A noveI mechanism of diabetic vasculopathy．

[8] Lin CL,Wang FS,et al.Modulation of notch-1 signaling alleviates vascular endothelial growth factor-mediated diabetic nephropathy.Diabetes,2010,59(8):1915-1925.

Expression of Notch-1 in retina of diabetic rats at early stage

GAONa

(ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan,610075)

Objective Notch receptors and the Delta-like ligand 4 signaling pathway was shown to participate in the process of diabetic retinopathy.However,the function of this signaling pathway in diabetic retinopathy was still unknown.So this study was designed to investigate the expression change of Notch-1 in early stage of diebetes mellitus (DM) of SD rats’ retina.Methods DM was induced in 2-month-old male 40 Sprague-Dawley rats,which were randomly divided into 4 groups (control 1 and 2 month group,DM model 1 and 2 month group).DM animal models were all set with 60mg/Kg streptozocin intraperitoneal injection.After 1 and 2 month,Notch-1 expression in retinal was detected with immunohistochemical stainning and western blot,and compared with that of 1 and 2 month control group.Results The immunohistochemical results showed that Notch-1 expressed intensly in diabetic rats retinal ganglion cell layer,which is expressed significantly higher than in normal rat．Western blot showed that the expression of Notch-1 protein were also higher in DM 1 month group and DM 2 month group than that in normal group,while there were no significant difference between the two DM groups.Conclusion The expression of Notch-1 increased in retinal ganglion cell layer of the early stage in diabetic rats,which may play an essential role in the process of diabetic retinopathy．

Diabetic mellitus; Diabetic retinopathy; Notch-1

610075,四川成都,成都中醫藥大學

高娜,E-mail:346508571@qq.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2016.04.003

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