丙泊酚對老年大鼠認知功能及海馬區nNOS、血清β-淀粉樣蛋白的影響

張煥，苑韜，時艷杰

(遼寧中醫藥大學附屬醫院麻醉科沈陽醫學院附屬第三醫院麻醉科，遼寧 沈陽 110032)

丙泊酚對老年大鼠認知功能及海馬區nNOS、血清β-淀粉樣蛋白的影響

張煥，苑韜，時艷杰

(遼寧中醫藥大學附屬醫院麻醉科沈陽醫學院附屬第三醫院麻醉科，遼寧 沈陽 110032)

目的 探討丙泊酚對老年大鼠學習記憶及認知能力的影響及其可能的機制。方法選擇30只12個月齡SD大鼠，按分層隨機區組法隨機分為三組，每組10只，即訓練組、丙泊酚低劑量組和高劑量組。麻醉結束后24 h，采用不固定訓練次數隨機法連續5 d進行水迷宮的行為學測試：記錄各組的逃避潛伏期、穿越平臺次數。測試結束抽取大鼠血后立即斷頭取腦，采用免疫組化染色法檢測大鼠海馬區腦組織nNOS的表達情況及大鼠血清中β-淀粉樣蛋白含量。結果12個月齡SD大鼠丙泊酚麻醉后各組同時段水迷宮行為學測試的結果顯示：高劑量組與訓練組比較，逃避潛伏期顯著延長、穿越平臺次數顯著減少，差異有統計學意義(P＜0.01，t=12.142、5.63)；低劑量組與訓練組比較，差異無統計學意義(P＞0.05，t=0.386、0.773)。免疫組化染色的結果顯示：高劑量組海馬區nNOS陽性細胞數和積分光密度值(IOD)明顯低于低劑量組和訓練組，差異有統計學意義(P＜0.01，t=12.072、11.646)；低劑量組與訓練組比較，兩項指標差異無統計學意義(P＞0.05，t=0.642)。高劑量組與低劑量組、訓練組比較，血清β-淀粉樣蛋白含量增多，差異有統計學意義(P＜0.01，t=11.692、10.354)；低劑量組與訓練組比較，兩組血清β-淀粉樣蛋白含量比較，差異無統計學意義(P＞0.05，t=0.082)。結論多次高劑量丙泊酚注射麻醉誘導及維持對老年大鼠的學習記憶與認知功能損害與海馬區nNOS表達的抑制程度和血清β-淀粉樣蛋白含量有關。

丙泊酚；老年大鼠；認知功能；一氧化氮合酶；β-淀粉樣酶

近年來的動物實驗研究表明，持續應用某些全身靜脈麻醉藥物能夠對動物的學習記憶和認知功能產生不良影響，發生術后認知功能障礙(POCD)。通過臨床觀察和循證醫學調查，老年患者全身麻醉后發生POCD的比例相對較高[1]，目前多數學者認為大腦海馬區中的神經元型一氧化氮合酶(Neuron nitric oxide synthetase，nNOS)可能參與了學習記憶的重要環節和過程，同時nNOS又是合成神經遞質一氧化氮(Nitric oxide，NO)的關鍵酶[2]。由于淀粉樣蛋白(Aβ)是神經系統損傷和持續性炎癥反應的潛在標志物之一，因此還有學者認為POCD與麻醉藥物的使用和其引起β-淀粉樣蛋白的表達有關[3]。本實驗在建立丙泊酚麻醉動物模型的基礎上，通過Morris水迷宮進行神經行為學測試，觀察丙泊酚對老年大鼠空間學習記憶及認知功能的影響，同時采用免疫組化方法及測定大鼠血清中β-淀粉樣蛋白含量，為探討丙泊酚麻醉后老年大鼠空間學習記憶及認知能力變化的機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及麻醉方法 正式實驗前采用Morris水迷宮預先對所有大鼠進行游泳試驗，以淘汰先天運動功能障礙的大鼠。所有實驗大鼠由遼寧中醫藥大學動物實驗中心提供。選用通過測試的健康清潔級SD大鼠30只，體質量(291.26±9.41)g，12個月齡、雌雄各半。實驗前1 d使所有大鼠自由攝食飲水并熟悉實驗室環境。按分層隨機區組設計分為三組，每組10只：訓練組、低劑量組和高劑量組。訓練組大鼠予以腹腔注射0.9%氯化鈉注射液2 mL，對低劑量組實施麻醉誘導時給予腹腔注射1%丙泊酚(捷力康英國)50 mg/kg，高劑量組大鼠實施麻醉誘導時給予腹腔注射1%丙泊酚(捷力康英國)100 mg/kg，麻醉維持期間分別每小時追加首次劑量的半量并持續6 h。所有大鼠每次腹腔注射相應實驗劑量的藥物后立即放入吸氧箱內，持續吸入純氧，流量5 L/min。翻正反射完全恢復正常后，立即從吸氧箱中取出大鼠完成動物模型的建立。麻醉期間用脈搏血氧飽和度監護儀的探頭貼于大鼠腹部持續監測脈搏氧飽和度，以防麻醉過深導致的大鼠缺血缺氧性腦損害對實驗結果產生影響。

1.2 動物行為學測試 連續用藥6 d后以Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司)進行學習記憶功能測試，實驗前，將平臺置于水迷宮東北象限中央，沒于水下2 cm，水池內加入適量墨汁，使大鼠無法識別平臺，在迷宮池壁外粘貼幾件物體作為參照物，將水溫加熱至24°C～26°C。定位航行實驗設定為5 d，每天固定分上下午兩個時間段，每時間段分別訓練4次。將大鼠分別從不同象限把動物放入水中，利用秒表記錄大鼠找到平臺的時間(逃避潛伏期)，每次間隔時間設定為1 min。第5天下午施行空間探索實驗，移出平臺，將大鼠從西南象限放入水中，用攝像機記錄2 min內動物在迷宮中的游泳路徑并記錄穿越平臺位置次數作為記憶成績。

1.3 神經型一氧化氮合酶檢測 學習記憶能力測試結束后立即抽取各組大鼠血3 mL，以3 000 r/min離心5 min，吸取血清置于-30°C待測。再以4%多聚甲醛預灌注后斷頭取腦，采用免疫組化SP法對各組大鼠海馬組織中的nNOS進行檢測。常規制備石蠟切片后，脫蠟至水化，再采用微波法進行抗原修復，分別依次滴加3%H2O2，山羊血清，一抗(1:500稀釋)4℃孵育過夜，二抗，37℃孵育1h，滴加DAB顯色液進行顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片后，在數碼顯微鏡下采集照片，應用Leica Q550CW圖象采集和分析系統，取每只大鼠海馬區3張切片進行鏡下(40×10)觀察，選取每張切片5個互不重疊的視野，測定其單位面積陽性細胞表達的光密度值，分別采集5個視野的平均光密度值作為本實驗數據以反映nNOS陽性表達情況。

1.4 淀粉樣蛋白含量檢測 采用酶聯免疫吸附(ELISA)法分別檢測各組待測大鼠血清，測定血清中的淀粉樣蛋白含量，檢測方法嚴格按照試劑盒中說明書進行。

2 結 果

2.1 各組逃避潛伏期、穿越平臺次數比較 高劑量組與訓練組相比，逃避潛伏期顯著延長、穿越平臺次數顯著減少，差異有統計學意義(P＜0.01)；低劑量組與訓練組相比，兩項指標差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 各組大鼠水迷宮結果(±s)

表1 各組大鼠水迷宮結果(±s)

注：高劑量組與訓練組比較(高劑量組與訓練組逃避潛伏期at=12.142，高劑量組與訓練組空間探索at=5.63)，aP＜0.01。低劑量組與訓練組比較(低劑量組與訓練組逃避潛伏期bt=0.386，低劑量組與訓練組空間探索bt=0.773)，bP＞0.05。

組別 只數 逃避潛伏期(s)空間探索(穿越平臺次數)訓練組低劑量組高劑量組10 10 10 1.900 0±1.042 68a2.100 0±1.261 88b21.200 0±4.917 09a6.200 0±1.635 29a6.800 0±1.829 27b2.500 0±1.281 14a

2.2 各組海馬區nNOS陽性細胞和積分光密度值(IOD)比較 免疫組化染色的結果顯示：高劑量組海馬區nNOS陽性細胞數和積分光密度值(IOD)明顯低于訓練組和低劑量組，差異有統計學意義(P＜0.01)；而低劑量組與訓練組比較，兩項指標差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 各組大鼠海馬組織中nNOS平均光密度(±s)

表2 各組大鼠海馬組織中nNOS平均光密度(±s)

注：高劑量組與訓練組比較(t=12.072)，aP＜0.01，高劑量組與低劑量組比較(t=11.646)abP＜0.01，低劑量組與訓練組比較(t=0.642)，bP＞0.05。

組別 只數NOS訓練組低劑量組高劑量組10 10 10 0.376 8±0.059 93a0.362 1±0.040 63b0.135 7±0.019 93a

2.3 各組血清β-淀粉樣蛋白含量比較 高劑量組與低劑量組和訓練組比較，血清β-淀粉樣蛋白含量增多，差異有統計學意義(P＜0.01)低劑量組與訓練組相比，兩項指標差異無統計學意義(P＞0.05)。見表3

表3 各組大鼠血清中Aβ含量(±s)

表3 各組大鼠血清中Aβ含量(±s)

注：高劑量組與訓練組比較，t=11.692，aP＜0.01，高劑量組與低劑量組比較，t=10.354，P＜0.01，低劑量組與訓練組比較，t=0.080，bP＞0.05。

組別 只數 淀粉樣蛋白(Aβ，pg/mL)訓練組低劑量組高劑量組10 10 10 28.926 7±7.933 57a29.219 3±8.402 87b168.97±36.933 57a

2.4 各組海馬組織免疫組化染色檢測 免疫組織化學染色結果顯示，附著于神經細胞膜的褐色顆粒為陽性表達產物，高劑量組陽性表達產物明顯低于訓練組和低劑量組，見圖1。

圖1 丙泊酚對各組大鼠海馬區nNOS表達的影響(40×10)

3 討 論

POCD是指受多種因素影響的麻醉手術后患者發生記憶力、定向力、抽象思維等障礙的急性神經系統綜合征，高齡是最為重要的危險因素，有研究表明老年患者術后認知功能障礙的發生率高達30%左右[4]。POCD的病理機制目前尚不明確。有學者認為其與阿爾茨海默病(AD)的發生可能有共同的病理基礎[5]：其基本的病理學特征為中樞膽堿能系統功能降低、神經元纖維纏結和β淀粉樣蛋白聚集[6-7]。

學習記憶的重要解剖學基礎與中樞神經系統相關，特別是與大腦邊緣系統的重要組成部分—海馬關系密切[8]。海馬區中合成神經遞質一氧化氮(NO)進而參與學習記憶的關健酶是神經型一氧化氮合酶(nNOS)；同時大多數學者認為，學習記憶的神經生理學基礎是大腦海馬部位突觸傳遞效能的長時程增強與放大現象(Long-term potentiation，LTP)[9-10]；還有動物實驗研究表明，有些麻醉鎮靜藥導致學習記憶及認知功能受損是恰恰是通過激活神經中樞抑制性遞質—氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid，GABA)受體，從而抑制離體海馬腦片的長時程增強與放大效應，并使突觸傳遞的可塑性受到嚴重影響，進一步引起nNOS表達下降所致[11]。

Aβ是AD細胞核中老年斑的始動因子和主要成分，在大腦Aβ增多與認知功能障礙關系密切[12]，Aβ可以導致神經元間信息傳遞受阻，并引發神經細胞凋亡，從而引起學習記憶障礙。Aβ表達不僅可致神經元突觸功能障礙，還可通過蛋白激酶和糖原合成酶激酶的激活引起tau蛋白過度磷酸化，進而引起神經退行性疾病；Aβ不僅對神經細胞具有直接的毒性作用導致炎癥反應，其本身也能產生自由基和反應性氧化物，通過損傷膜脂質導致神經退行性變[13-14]。大腦Aβ聚集反映血漿中Aβ生成增加，因此血漿中Aβ的濃度改變可以間接反映腦組織中Aβ的聚集情況[15]。麻醉藥物丙泊酚的持續大劑量應用能夠對動物的認知功能造成不良影響，甚至產生術后學習記憶能力的嚴重受損[16]。

本實驗結果表明，多次重復腹腔注射高劑量(100 mg/kg)丙泊酚并維持麻醉后，老年SD大鼠的學習記憶及認知功能受損，高劑量組逃避潛伏期顯著延長、穿越平臺次數顯著減少，海馬區nNOS陽性細胞數和積分光密度值(IOD)明顯低于訓練組和低劑量組，血清β-淀粉樣蛋白含量顯著增多，這種損傷程度與丙泊酚的劑量相關。

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Effects of propofol on cognitive function,hippocampus nNOS and serum amyloid β-protein in aged rats.

ZHANG Huan,YUAN Tao,SHI Yan-jie.Department of Anesthesiology,Affiliated Hospital of Liaoning Chinese Medicine Uiversity; Department of Anesthesiology,Third Affiliated Hospital of Shenyang Medical College,Shenyang 110032,Liaoning,CHINA

ObjectiveTo explore the effects of propofol on learning and memory of elderly rats and its possible mechanism.MethodsThirty Sprague-Dawley(SD)rats(average age,12 months)were chosen and randomly assigned to one of three groups(n=10 for each group):training group,propofol low dose group and high dose group.24 hours after anesthesia,no fixed number of random training method was used for behavioral tests in the water maze for five days,and the escape latency and the number of across the platform were recorded.After behavioral tests were finished,the blood was drawn,after which the rats were immediately killed by decapitation.Then,the expression of nitric oxide synthase(nNOS)in the hippocampus area of brain tissue and the content of serum amyloid β-protein were detected by immunohistochemical staining method.ResultsThe behavioral tests in water maze showed that compared with training group,propofol high dose group had the significantly longer escape latency and significantly less number of across the platform(t=12.142,t=5.63,respectively,P＜0.01);There was no significant difference between the training group and propofol low dose group in the two same indexes(t=0.38 and 0.773,respectively,P＞0.05).According to the results of immunohistochemical staining,the nNOS positive cells in hippocampus and integral optical density(IOD)of propofol high dose group were significantly lower than those of the propofol low dose group and training group(t= 12.072,t=11.646,respectively,P＜0.01);There was no significant difference between the training group and propofol low dose group in the two same indexes(t=0.642,P＞0.05);Compared with propofol low dose group and training group, the amyloid β-protein content in propofol high dose group significantly increased(t=11.692 and 10.354,respectively P＜0.01);There was no significant difference between propofol low dose group and training group in the amyloid β-protein content(P＞0.05,t=0.082).ConclusionAnesthesia using multiple high dose injection of propofol can induce and maintain the damage on learning and memory function of elderly rats,which has the close relationship with the inhibition degree of hippocampus nNOS expression and the content of Serum amyloid β-protein.

Propofol;Aged rats;Cognitive function;Nitric oxide synthase(nNOS);Serum amyloid β-protein

R-332

A

1003—6350（2016）10—1554—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.002

2016-01-12)

遼寧省教育廳科研項目(編號：L2013378)

苑韜。E-mail：ytshy@sohu.com