人參皂苷對波動性高血糖模型大鼠動脈HO-1、γ-GCS表達的影響

駱陽陽黃 琦馮小紅

人參皂苷對波動性高血糖模型大鼠動脈HO-1、γ-GCS表達的影響

駱陽陽1黃 琦2馮小紅2

目的觀察人參皂苷對波動性高血糖模型大鼠動脈血紅素氧合酶-1（HO-1）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）表達的影響。方法 將48只雄性SD大鼠隨機分成正常對照組（n=8）和糖尿病模型組（n=40）。高脂飼料喂養糖尿病模型組大鼠2周后用小劑量鏈脲佐菌素（STZ）誘導建立糖尿病大鼠模型，之后隨機分為穩定性高糖組（n=8）和波動性高糖組（n=32），波動性高糖組錯時注射葡萄糖、胰島素制備血糖波動大鼠模型。2周后，將波動性高糖組大鼠隨機分為人參皂苷低劑量組[14mg/（kg·d）]、人參皂苷中劑量組[28mg/（kg·d）]、人參皂苷高劑量組[56mg/（kg·d）]及波動性高糖空白組，每組8只，予人參皂苷低、中、高劑量干預相對應的模型組8周。實驗結束后取大鼠動脈組織，采用Rt-PCR、Western blot測定HO-1、γ-GCS mRNA及蛋白表達。結果與正常對照組比較，糖尿病模型組HO-1、γ-GCS mRNA及蛋白表達明顯增加（均P＜0.05）；與穩定性高糖組比較，波動性高糖空白組、人參皂苷給藥組（低、中、高）HO-1、γ-GCS mRNA表達均明顯增加[（19.66± 1.20，15.53±0.87），（21.72±2.27，18.85±1.93），（23.82±0.50，21.65±2.17），（25.90±1.13，26.30±1.68）比（17.30±0.56，12.50±0.97），均P＜0.05]，蛋白表達量均明顯增加[（64.78±0.25，67.21±0.68），（77.34± 0.29，83.48±0.43），（82.65±0.29，94.39±0.22），（92.71±0.20，107.73±1.28）比（63.28±0.29，59.20± 0.66），均P＜0.05]；與波動性高糖空白組比較，人參皂苷給藥組（低、中、高）HO-1、γ-GCS mRNA表達均明顯增加 [（21.72±2.27，18.85±1.93），（23.82±0.50，21.65±2.17），（25.90±1.13，26.30±1.68）比（19.66±1.20，15.53±0.87，均P＜0.05]，蛋白表達量均明顯增加 [（77.34±0.29，83.48±0.43），（82.65± 0.29，94.39±0.22），（92.71±0.20，107.73±1.28）比（64.78±0.25，67.21±0.68），均P＜0.05]；與人參皂苷低劑量組比較，人參皂苷中、高劑量組HO-1、γ-GCS mRNA表達明顯增加[（23.82±0.50，21.65±2.17），（25.90±1.13，26.30±1.68）比（21.72±2.27，18.85±1.93），均P＜0.05]，蛋白表達量明顯增加[（82.65± 0.29，94.39±0.22），（92.71±0.20，107.73±1.28）比（77.34±0.29，83.48±0.43），P＜0.05]；與人參皂苷中劑量組比較，人參皂苷高劑量組HO-1、γ-GCS mRNA表達明顯增加 [（25.90±1.13，26.30±1.68）比（23.82±0.50，21.65±2.17），均P＜0.05]，蛋白表達明顯增加[（92.71±0.20，107.73±1.28）比（82.65± 0.29，94.39±0.22），均P＜0.05]。結論 人參皂苷可增加波動性高血糖模型大鼠HO-1、γ-GCS mRNA及蛋白表達水平，減輕血管內皮損傷，可能降低波動性高血糖大鼠機體的氧化應激水平，提高抗氧化能力，對波動性高血糖所導致的動脈病變有一定保護作用。

大鼠；波動性高糖；人參皂苷；動脈；血紅素氧合酶-1；γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養條件 6～8周齡雄性SPF級

SD大鼠48只，體質量160～180g，由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供[SCXK（滬）2008-0016]。溫度（20±2）℃，相對濕度50%～60%，光照12h明暗交替，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心[SYXK（浙）2008-0115]。

1.2 藥品及儀器 人參皂苷粉末（由浙江中醫藥大學中藥研究室提供）；超短效胰島素諾和銳（丹麥諾和銳）；鏈脲佐菌素；血糖試紙及血糖儀（德國羅氏）；自制高脂飼料：基礎飼料69.5%、蔗糖10%、豬油10%、膽固醇0.5%、蛋黃10%。

1.3 方 法

1.3.1 糖尿病動物模型制備 將48只雄性SD大鼠隨機分成正常對照組8只和糖尿病模型組40只。普通飼料喂養正常對照組，高脂飼料喂養糖尿病模型組大鼠。2周后所有大鼠禁食不禁水16h，糖尿病模型組大鼠予小劑量鏈脲佐菌素（STZ）35mg/kg腹腔注射誘導建立糖尿病模型，造模1周后，禁食不禁水16h，測空腹血糖為15～20mmol/L為模型制作成功。

1.3.2 血糖波動模型制備 將40只糖尿病模型大

鼠隨機分為穩定性高糖組（n=8）和波動性高糖組（n= 32），波動性高糖組大鼠錯時注射葡萄糖、胰島素制備血糖波動大鼠模型。正常對照組大鼠給予腹腔注射生理鹽水0.375g（/kg·d）作為對照。穩定性高糖組大鼠定時給予腹腔注射250g/L葡萄糖溶液0.375g/ （kg·d）。波動性高糖組定時給予腹腔注射250g/L葡萄糖溶液0.375s（/kg·d），錯時30min后給予腹腔注射超短效胰島素類似物諾和銳，造成1天中血糖值大幅度波動模型，使其血糖值在高血糖和低血糖間反復漂移，注射后30min測血糖，連續6周。波動性高糖組血糖波動幅度（AGE）＞1SD為有效波動。制做血糖波動模型2周后，將波動性高糖組再隨機分為人參皂苷低劑量組、人參皂苷中劑量組、人參皂苷高劑量組及波動性高糖空白組，各8只。藥物干預組予人參皂苷低、中、高劑量[14mg、28mg、56mg（/kg·d）]干預8周，波動性高糖空白組予等量生理鹽水作對照。1.4 標本采集及指標測定 實驗結束后所有大鼠禁食不禁水12h，予10%水合氯醛1ml/kg腹腔注射麻醉，處死大鼠后取部分主動脈組織，運用RT-PCR、Western blot檢測波動性高糖及人參皂苷干預對細胞內HO-1、γ-GCS mRNA和蛋白的表達。

2 結 果

2.1 一般情況 正常對照組大鼠飲食水，尿量正常，體質量逐漸增加，毛色白而有光澤。糖尿病模型組大鼠給予自制高脂飼料飲食后，開始體質量增加明顯，造模后穩定性高糖組大鼠出現多飲、多尿、多食，癥狀逐漸加重，毛色易臟無光澤，精神萎靡，對外界反應遲鈍，行動遲緩，進食減少，尿液腥臊味加重，尾部破潰糜爛，多數大鼠體質量明顯減輕。波動性高糖空白組較穩定性高糖組癥狀更明顯，人參皂苷低中、高劑量組大鼠較兩模型組大鼠精神明顯好轉，反應較靈敏，活動力較強，毛色較光澤，尿液腥臊味減輕，尾部破潰部位好轉有結痂，體質量較兩模型組亦明顯增加。

2.2 各組大鼠動脈組織HO-1、γ-GCS mRNA表達比較 與正常對照組比較，穩定性高糖組、波動性高糖空白組及人參皂苷高、中、低劑量給藥組大鼠動脈組織HO-1、γ-GCS mRNA均明顯增加（P均＜0.05）；與穩定性高糖組比較，波動性高糖空白組、人參皂苷高、中、低劑量給藥組HO-1、γ-GCS mRNA明顯增加（P均＜0.05）；與波動性高糖空白組比較，人參皂苷高、中、低劑量給藥組HO-1、γ-GCS mRNA表達明顯上升（P均＜0.05）；與人參皂苷低劑量組比較，人參皂苷中、高劑量組HO-1、γ-GCS mRNA明顯升高（P均＜0.05）；與人參皂苷中劑量組比較，人參皂苷高劑量組HO-1、γ-GCS mRNA表達量明顯增加（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 各組大鼠動脈組織HO-1、γ-GCS mRNA表達量比較（±s）

表1 各組大鼠動脈組織HO-1、γ-GCS mRNA表達量比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與穩定性高糖組比較，#P＜0.05；與波動性高糖空白組比較，▲P＜0.05；與人參皂苷低劑量組比較，△P＜0.05；與人參皂苷中劑量組比較，●P＜0.05；HO-1：血紅素氧合酶-1；γ-GCS：γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶

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2.3 各組大鼠動脈組織HO-1、γ-GCS蛋白表達比較 與正常對照組比較，穩定性高糖組、波動性高糖空白組、人參皂苷高、中、低劑量給藥組大鼠動脈組織HO-1、γ-GCS蛋白表達均明顯增加（均P＜0.05）；與穩定性高糖組比較，波動性高糖空白組、人參皂苷高、中、低劑量給藥組HO-1、γ-GCS蛋白表達明顯增加（均P＜0.05）；與波動性高糖空白組比較，人參皂苷高、中、低劑量給藥組HO-1、γ-GCS蛋白表達有明顯上升（均P＜0.05）；與人參皂苷低劑量組比較，人參皂苷中、高劑量組HO-1、γ-GCS蛋白表達量明顯增加（均P＜0.05）；與人參皂苷中劑量組比較，人參皂苷高劑量組HO-1、γ-GCS蛋白表達量明顯增加（均P＜0.05）。見表2、圖2。

3 討論

隨著對糖尿病研究的不斷深入,人們己逐漸認識到糖尿病的本質是血管病變,內皮功能失衡是血管病變發生和發展的始動和核心環節[4]，且與高血糖狀態下內皮細胞發生氧化應激密切相關。近年研究表明，波動性高血糖相對于持續性高血糖更能促進糖尿病患者慢性血管并發癥的發生與發展，從而成為新近糖尿病血管并發癥防治領域的一個研究熱點[5]。本實驗通過人參皂苷對波動性高血糖大鼠模型的干預，顯示波動性高糖組動脈HO-1、γ-GCS mRNA及蛋白表達明顯高于穩定性高糖組，且人參皂苷治療后其基因表達進一步增加。

圖1 高血糖及人參皂苷對氧化應激下HO-1、γ-GCS mRNA表達的影響

表2 各組大鼠動脈組織HO-1、γ-GCS蛋白表達量比較（x±s）

圖2 高血糖及人參皂苷對氧化應激下HO-1、γ-GCS蛋白表達的影響

高血糖通過氧化應激誘導組織和血管疾病損傷。氧化應激是高活性分子例如活性氧簇（ROS）和活性氮物種（RNS）的過度形成或清除不足形成的。氧化應激反應產生的最初效應是誘導機體一系列抗氧化基因的表達，這些基因中有些表達抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶如血紅素加氧酶-1（HO-1），γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（y-GCS）、NAD（P）H：醌氧化還原酶1 （NQO1）等，能促使化學毒性物質和ROS解毒，防止自由基的產生，促進細胞存活[6]。HO-1是血紅素降解的限速酶,其抗氧化功能一方面與其阻止游離血紅素參與氧化反應有關，另一方面，HO-1及其酶解產物膽紅素、CO共同發揮著抗氧化、抗炎、抑制細胞凋亡等作用，廣泛參與組織細胞的抗氧化應激損傷，是機體最重要的內源性保護體系之一[7]。在某些抗氧化酶出現顯著增加之前，HO-1表達水平就已經顯著增高，提示HO-1可能是氧化損傷的一個早期生物標志物[8]。

γ-GCS是體內還原型谷胱甘肽（GSH）合成的限速酶，是一個由重鏈（γ-GCSh）和輕鏈（γ-GCSl）組成的二聚體。增加γ-GCS的含量和活性，可以促進GSH的合成，增強組織細胞抗氧化應激的能力[9]。本實驗中，糖尿病模型組動脈HO-1、γ-GCS mRNA及蛋白表達均較正常對照組有所增加，波動性高血糖大鼠組上述指標濃度的增加更為明顯，說明波動性高血糖大鼠機體內氧化應激水平增高，誘導血管內皮細胞凋亡，最終導致主動脈的病變。

糖尿病中醫稱為“消渴癥”，其病機為陰津虧虛，燥熱偏勝，治法是清熱潤燥、養陰生津。人參治療“消渴”早有記載?！渡褶r本草經》謂人參能“主補五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智。久服，輕身延年”。人參主要活性成分人參皂苷被認為是發揮降血糖作用的主要活性物質[10]。韓國學者Lee 等[11]研究發現，采用多種抗氧化實驗方法，如總抗氧化活性、還原能力、游離基清除、脂質過氧化實驗，證明人參皂苷能夠清除ROS，是一種優良的抗氧化劑。臨床研究亦證實人參皂苷在防治糖尿病及其并發癥方面具有確切的臨床療效[12-15]。本實驗結果表明不同濃度人參皂苷治療組均可不同程度地增高動脈HO-1、γ-GCS mRNA及蛋白表達水平。

綜上所述，人參皂苷可增高波動性高血糖大鼠動脈HO-1、γ-GCS表達水平，抑制氧化應激，提高機體抗氧化的能力，減少氧化應激所致的內皮細胞損傷，對波動性高血糖導致的動脈病變有一定的保護作用。

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（收稿：2016-03-03 修回：2016-05-12）

Ginsenoside on Arterial HO-1 and γ-GCS Expression in Rats with Fluctuating Hyperglycaemia

LUO Yangyang1,HUANG Qi2,FENG Xiaohong2.1 The First Clinical College,Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou(310000),China;2 Department of Endocrinology,Zhejiang Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310000), China

ObjectiveTo investigate the effects of ginsenoside on arterial hemeoxygenase-1（HO-1）and γ-glutamylcysteine synthetase（γ-GCS）expression of rats with fluctuating hyperglycaemia.MethodsForty-eight male Sprague-Dawley（SD）rats were randomly divided into healthy group（n=8）and diabetic model group（n=40）.Thediabetic rat model was established by injection of a small dose of streptozotoein after feeding them with high-fat diet for 2 weeks,then they were randomly divided into sustained high glucose group（n=8）and fluctuating high glucose group（n=32）.The model rats with high glucose fluctuation were developed by alternative intraperitoneal injection of insulin and glucose,then after 2 weeks were randomly divided into 4 groups：low[14mg/（kg·d）],middle [28mg/（kg·d）],high [56mg/（kg·d）]dosage of ginsenoside treatment group and control group,with 8 rats in each group.After 8 weeks,the expression of HO-1 and γ-GCS mRNA and protein were measured and compared.ResultsCompared with healthy group,the levels of HO-1 and γ-GCS in diabetic model group were significantly increased（P＜0.05）;compared with sustained high glucose group,the levels of HO-1 and γ-GCS mRNA in fluctuating high glucose group and ginsenoside treatment groups（low,middle,high） were significantly increased[（19.66±1.20,15.53±0.87）,（21.72±2.27,18.85±1.93）,（23.82±0.50,21.65±2.17）,（25.90±1.13,26.30±1.68）vs （17.30±0.56,12.50±0.97）;all P＜0.05];the same increase was observed in protein levels[（64.78±0.25,67.21±0.68）, （77.34±0.29,83.48±0.43）,（82.65±0.29,94.39±0.22）,（92.71±0.20,107.73±1.28）vs（63.28±0.29,59.20±0.66）;all P＜0.05].Compared with fluctuating high glucose group,the levels of HO-1 and γ-GCS mRNA in ginsenoside treatment groups（low,middle,high）were significantly increased[（21.72±2.27,18.85±1.93）,（23.82±0.50,21.65± 2.17）,（25.90±1.13,26.30±1.68）vs（19.66±1.20,15.53±0.87）;all P＜0.05],as well as the expression of protein[（77.34±0.29,83.48±0.43）,（82.65±0.29,94.39±0.22）,（92.71±0.20,107.73±1.28）vs（64.78±0.2,67.21±0.68）;all P＜0.05].Compared with low-dose ginsenoside group,middle-dose and high-dose ginsenoside groups had higher levels of HO-1 and γ-GCS mRNA[（23.82±0.50,21.65±2.17）,（25.90±1.13,26.30±1.68）vs（21.72±2.27,18.85±1.93）;all P＜0.05]and protein[（82.65±0.29,94.39±0.22）,（92.71±0.20,107.73±1.28）vs（77.34±0.29,83.48±0.43）;all P＜0.05]. Compared with middle-dose ginsenoside group,high-dose ginsenoside group had increased levels of HO-1 and γ-GCS mRNA [（25.90±1.13,26.30±1.68）vs（23.82±0.50,21.65±2.17）;P＜0.05]and protein [（92.71±0.20,107.73± 1.28）vs（82.65±0.29,94.39±0.22）;P＜0.05].ConclusionGinsenoside can increase the level of HO-1 and γ-GCS both in mRNA and protein and reduce vascular endothelial damage.Therefore ginsenoside may reduce the oxidative stress level of rats wiht high blood-glucose fluctuation,improve the antioxidant capacity,which could play a critical role in treating vascular disease caused by high blood-glucose fluctuation.

rats;fluctuating hyperglycaemia;ginsenoside;artery;hemeoxygenase-1;γ-glutamylcysteine synthetase糖尿病大血管病變是糖尿病患者致死致殘的重要原因[1]。有證據表明，相對于持續性高血糖，波動性高血糖更能增加糖尿病患者發生慢性血管并發癥的危險性[2]。目前，波動性高血糖致內皮細胞凋亡的機制尚未清楚，但大量研究表明，內皮細胞發生氧化應激損傷在糖尿病大血管病變的發生發展中發揮著重要作用。因此，通過運用抗氧化應激策略及控制血糖波動水平防治糖尿病大血管病變成為當今的研究熱點。近年來，人參治療和預防糖尿病及其并發癥的作用受到廣泛關注。人參皂苷作為人參的主要活性成分，具有較強的抗氧化和自由基清除能力[3]。本研究從氧化應激角度入手，觀察人參皂苷對波動性高血糖大鼠動脈血紅素氧合酶-1（hemeoxygenase-1，Ho-1）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamic acid and a half long glycine synthetase，γ-GCS）表達的影響。

浙江省中醫藥科技計劃項目（No.2014ZA045）

1浙江中醫藥大學第一臨床醫學院中西醫結合臨床醫學內分泌方向（杭州 310053）；2浙江省中醫院內分泌科（杭州 310000）

黃琦，Tel：13588887338；E-mail：hq871201@163.com