疏肝降肺法對“激怒”傷模型大鼠海馬區神經遞質及子宮、卵巢ER-β的影響

殷一紅王小云陽少輝

疏肝降肺法對“激怒”傷模型大鼠海馬區神經遞質及子宮、卵巢ER-β的影響

殷一紅1王小云2陽少輝3

目的探討疏肝降肺法對“激怒”傷模型大鼠海馬區神經遞質活性及子宮-卵巢雌激素受體-β（ER-β）的影響。方法將24只雌性SD大鼠隨機分為正常對照組、“怒”模型組、疏肝降肺湯組，每組8只。采用夾尾間接激怒法建立“怒”大鼠模型。疏肝降肺湯組給予相應中藥灌胃[7.56g/ （kg·d）]，正常組及模型組給予等量生理鹽水灌胃，共計4周。觀察各組大鼠額葉皮質、海馬組織神經遞質及子宮-卵巢雌激素受體β（ER-β）含量差異。高效液相-電化學法測定神經遞質包括去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）、五羥色胺（5-HT）含量及免疫組化法測定子宮、卵巢ER-β表達量。結果與正常組比較，模型組大鼠海馬區NE、DA、5-HT含量均增加 [NE：（78.53±8.64）ng/g比（37.38± 11.08）ng/g，P＜0.01；DA：（41.78±11.26）ng/g比（21.56±10.72）ng/g，P＜0.01；5-HT：（26.48±9.67）ng/g比（10.59±5.05）ng/g，P＜0.01]；與模型組比較，疏肝降肺湯組大鼠海馬區NE、DA、5-HT含量均減少[NE：（36.80±10.75）ng/g比（78.53±8.64）ng/g，P＜0.01；DA：（23.04±6.17）ng/g比（41.78±11.26）ng/g，P＜0.01；5-HT：（12.20±12.07）ng/g比（26.48±9.67）ng/g，P＜0.01]；疏肝降肺湯組大鼠對ER-β積分光密度增加有一定改善作用，但組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結論疏肝降肺法對“激怒”傷模型大鼠神經遞質紊亂及卵巢功能損傷有一定的調節改善作用，可能是臨床治療“怒”情志所致疾病的作用機制。

大鼠；激怒傷模型；疏肝降肺；神經遞質；ER-β；去甲腎上腺素；多巴胺；五羥色胺

心理因素是引起人類疾病的重要因素[1]。而“怒”是人體的精神狀態對客觀事物的反映，是造成內傷雜病的重要致病因素之一[2]。廣東省名中醫王小云教授總結出“以肝為重，調肺為輔”論治情緒疾病的治療原則，提出治療“憤怒、郁怒”相關情志疾病，治以“疏肝養肝，降肺理肺”。本研究旨在通過動物實驗探討疏肝降肺法對“激怒”傷模型大鼠神經遞質活性及子宮-卵巢雌激素受體β（es+rogen receptorβ，ER-β）的影響，探討疏肝降肺法治療“激怒”情緒致病的可能潛在作用機制，為中醫“諸氣憤郁，皆屬于肺”理論提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 2月齡雌性SD大鼠24只，體質量180～220g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。室溫控制在22-26℃，安靜環境下飼養。自由飲水攝食，每天保持12h明暗環境。動物合格證號：SCXK（粵）2008-0020。

1.2 儀器和試劑 臺式微量離心機：美國Beckman Coulter公司Mierofuge 16型；超純水系統：美國Mi11iPore公司 MILLI-Q A10 Aeademic Gradient Biocel Synthesis；電熱恒溫水浴箱：上海一恒科技有限公司CU-420型；數碼生物顯微鏡：廣州粵顯光學儀器有限責任公司MC-1180型；轉移脫色搖床：江蘇其林貝爾儀器制造有限公司TS-8型；電化學高效液相色譜儀：美國waters公司Model 2465 Eleetromechanical Detector，Model 2998 Photodiode Array Detector，Model 2695 SeParation Module。去甲腎上腺素（批號100169-199402）、5-羥色胺（批號111656-200401）、5-羥吲哚乙酸（批號140737-200501）均由中國藥品生物制品檢定所提供。ER-β抗體：北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 藥物制備 疏肝降肺湯（柴胡、香附、白芍、白術、熟地、前胡等）。按大鼠體表面積計算法，每只大鼠每日服用生藥約7.56g/kg，中藥水煎服，煎成含1g生藥/mL濃縮液，4℃保存，每次使用前搖勻。

2 實驗方法

2.1 模型制備及分組 參照文獻[3]，運用夾尾間接激怒法建立“怒”大鼠模型。

2.2 給 藥 根據抽取的隨機數字從小到大排序分為正常對照組、“怒”模型組（模型組）、疏肝降肺湯組（中藥組），每組8只。另外群居飼養10只大鼠作為入侵鼠。據體質量計算給藥量，連續給藥4周。正常對照組及模型組給予等量的生理鹽水灌胃，自由飲食飲水。末次給藥24h內腹腔內注射麻醉后，斷頭處死，開顱迅速分離出大鼠腦額葉皮質、海馬組織并取子宮、卵巢行相關指標檢測。

2.3 指標檢測方法

2.3.1 高效液相-電化學法測定NE、DA、5-HT 分別取額葉皮質、海馬稱重檢測。方法如下：（1）配制蛋白沉淀工作液、混合標準品貯備液及緩沖液；（2）將標本加入0.1mol/L的高氯酸溶液0.5mL、0.3mL，冰浴勻漿，勻漿液渦旋震蕩2min混勻后離心（12 000r/ min）10min，取上清液80μL進樣。（3）色譜條件：色譜柱：美國Phenomenex公司Luna C18色譜柱（150mm× 4.6mm，5μm）；預柱：美國Phenomenex公司C18柱（4mm×3mm，5μm）；流動相：緩沖液(1L超純水中含有NaH2PO4 31.29、乙二胺四乙酸二鈉37.2mg、辛烷磺酸鈉1g，H3PO4調pH值至3.7）：乙腈=89.5：10.5，流速：1ml/min；柱溫箱：35℃；自動進樣器溫度：8℃；檢測電壓：600mV；進樣量：80μL。

2.3.2 免疫組化測定子宮、卵巢ER-β 取子宮、卵巢組織，制備石蠟切片。按試劑盒說明進行，方法如下：（1）石蠟包埋的切片常規脫蠟脫水；（2）抗原微波熱修復：將組織切片放入0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（PH6.0），在微波爐里加熱5min至沸騰后，斷電，冷卻到室溫，反復2次。PBS洗2次，每次5min；（3）滴加5%BSA封閉液，室溫20min，甩去多余液體；（4）滴加一抗（100倍稀釋的ER-β抗體），4℃過夜，PBS 洗3次每次2min。滴加生物素化二抗，37℃20min，PBS洗3次每次2min；（5）滴加鏈霉素化親和素試劑，37℃20min，PBS洗4次每次5min；（6）DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）；（6）蒸餾水洗，蘇木素復染2min、飽和磷酸氫二鈉分化；（7）脫水、透明、封片、鏡檢。光鏡觀察ER-β的表達，所有切片放大倍數400×。每張切片觀察6～12個視野，免疫組化結果以單個視野下積分光密度IOD表示。采用Imaga-ProPlus 6.0軟件分析。

2.4 統計學方法 應用SPSS18.0統計軟件處理數據，計量資料以（±s） 表示，計量分組資料治療后三組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較，如服從正態分布且方差齊性，采用LSD檢驗進行分析，如非正態分布或方差不齊采用秩和檢驗進行分析。

3 實驗結果

3.1 三組大鼠海馬區NE、DA、5-HT含量比較 與正常組比較，模型組NE、DA、5-HT含量均增加（P＜0.01）；與模型組比較，疏肝降肺湯組NE、DA、5-HT含量均減少（P＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠海馬區NE、DA、5-HT含量比較（ng/g±s）

表1 各組大鼠海馬區NE、DA、5-HT含量比較（ng/g±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01

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3.2 三組大鼠子宮-卵巢ER-β積分光密度比較與正常組比較，疏肝理肺湯組、模型組大鼠子宮、卵巢ER-β積分光密度含量均減少，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。大鼠子宮及卵巢組織ER-β表達組織切片，見圖1。

表2 三組大鼠子宮-卵巢ERβ積分光密度比較（IOD，±s）

表2 三組大鼠子宮-卵巢ERβ積分光密度比較（IOD，±s）

組別正常組模型組疏肝降肺湯組鼠數8 8 8子宮11.16±3.99 8.70±3.46 10.85±3.25卵巢9.05±1.91 8.27±1.31 8.66±2.50

圖1 SD大鼠子宮及卵巢組織ER-β表達染色呈棕黃色（HE ×400）

4 討 論

中醫認為，情緒致病歸其病機為氣之病，《素問·舉痛論》有“余知百病生于氣也，怒則氣上，喜則氣緩，悲則氣消，……，思則氣結”記載。目前國內外諸多研究表明，大腦前額皮層功能與應對“怒”傷采取的應對方式相關，且怒傷會引起各腦區葡萄糖代謝異常[4-5]。現代醫學認為大腦前額皮層支配身體的兩側，中醫認為身體兩側為肝膽經走行之處。肝為罷極之本，精神調節之所，歷代醫家多從“疏肝、養肝、瀉肝、調肝”治療情緒相關疾病。同時《內經》亦載有“肺主宣發肅降，……諸氣憤郁，皆屬于肺……”、“諸氣者，皆屬于肺”理論，為臨證調肺治療情緒致病奠定理論基礎。

王小云教授認為臨證治療女性情緒致病，治肝同時加用“肺”經藥物以降肺氣、理肺氣，療效更著。本研究結果表明，怒傷大鼠海馬區神經遞質活性增強，與學者研究相似[6-7]。

ER-β可以調節雌激素受體α（estrogen receptor，ERα）的活性，是維持正常的卵巢功能必不可少的雌激素受體[8]，對卵泡的正常發育、卵母細胞的成熟具有重要的意義，當缺乏ER-β時，卵巢的功能將嚴重受到損傷[9]。國內外研究認為不良情緒可致月經異常[10-12]。實驗研究[13]表明，慢性應激會使雌鼠竇前卵泡及竇狀卵泡數減少，子宮內膜厚度明顯降低。本研究顯示，激怒應激使子宮、卵巢ER-β積分光密度含量減少，但差異無統計學意義（P＞0.05），由于本實驗未檢測ERα，或短時憤怒應激可能尚未能影響組織器官的ER-β的分布，值得進一步研究。

疏肝降肺湯由柴胡、香附、白芍、白術、熟地、前胡等藥組成。方中調氣從肝、肺二臟入手，柴胡、香附疏肝氣，前胡降肺氣，使氣機升降有條；白芍、熟地養肝、腎陰，補以通之，達到養肝疏肝的作用，且恐防理氣藥辛燥傷陰；白術，取“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾之意”。臨證用藥時可辨證加減，若氣郁偏熱，可易香附為郁金；若血虛酌加當歸補血之品；脾弱酌加山藥、茯苓之品等。

王小云教授臨證應用疏肝降肺湯辨證加減治療女性“怒”情志所致月經失調、痛經、不孕、更年期綜合征、經前期綜合征等疾病，效果甚佳。本研究認為疏肝降肺湯可能通過調節海馬區NE、5-HT、DA遞質的濃度，緩解不良應激所致的腦內單胺遞質的紊亂。對子宮、卵巢ER活性稍有改善，但差異無統計學意義，考慮可能跟用藥周期短有關。

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（收稿：2015-09-25 修回：2016-04-14）

Effect of Soothing Liver and Dropping Lung on Hippocampus Neurotransmitter and Estrogen Receptor βin the Uterus and Ovary of"Anger"Injured Rats

YIN Yihong1,WANG Xiaoyun2,YANG Shaohui3. 1 De-partment of Gynecology,Ningbo Municipal Hospital of TCM,Ningbo (315000),China;2 Department of Gynecology, Guangdong Provincial Hospital of TCM,Guangzhou (510120),China;3 Department of Gynecology,Yongzhou Municipal Maternal and Child Health Hospital,Yongzhou(425006),China

ObjectiveTo investigate the influence of the Chinese medical therapy of soothing liver and dropping lung on neurotransmitter activity and estrogen receptor β（ER-β）expression in uterine and ovarian tissues of model rats with chronic psychological stress of anger.MethodsSprague-Dawley（SD）rats were randomly divided into healthy group,model group,soothing liver and dropping lung group（n=8,respectively）.Except healthy group, rats in other groups was provoked indirectly by clamping tails to make anger stress model.Soothing liver and dropping lung group was given traditional Chinese medicine [7.56 g/（kg·d）]and healthy and model groups were given the equivalent volume of saline for 4 weeks.Neurotransmitter in the frontal cortex,hippocampus and ER-β in the uterus and ovaries were detected and compared.Norepinephrine（NE）,dopamin（DA）,serotonin（5-HT）were detected by HPLC-electrochemical method.ER-β expression in the uterus and ovaries was detected by immunohistochemical method.ResultsCompared with healthy group,NE,DA,and 5-HT contents in model group were significant increased（NE：78.53 8.64 ng/g vs 37.38 11.08 ng/g;DA：41.78 11.26 ng/g vs 21.56 10.72 ng/g;5-HT：26.48 9.67 ng/g vs 10.59 5.05 ng/g;all P＜0.01）.Compared with model group,the contents of NE,DA,and 5-HT in traditional Chinese medicine group was significantly reduced（NE：36.80 10.75 ng/g vs 78.53 8.64 ng/g;DA：23.04 6.17 ng/g vs 41.78 11.26 ng/g;5-HT：12.20 12.07 ng/g vs 26.48 9.67 ng/g;all P＜0.01）.Although the integral optical density of uterine and ovarian ER-β in trational Chinese medicine group reduced,no statistically significant difference was found between groups（P＞0.05）.ConclusionThe method of soothing liver and dropping lung may have protective effects on alteration of neurotransmitter activity and the injury of ovarian function caused by psychological stress of anger.This may be the potential mechanism of dealing with diseases caused by"anger".

rats;chronic psychological stress of anger model;soothing liver and dropping lung;neurotransmitter;estrogen receptor β;norepinephrine;dopamin;serotonin

浙江省中醫藥科技計劃項目（No.2015ZA189）

1浙江省寧波市中醫院婦科（寧波 315000）；2廣東省中醫院婦科（廣州 510120）；3湖南省永州市婦幼保健醫院婦科（永州 425006）

殷一紅，Tel：0574-87089065，E-mail：yinyihong.1985@163.com