結核分枝桿菌不同RNA提取方法的對比

譚 陽，尹 銳，徐亞維

(吉林農業科技學院生物工程學院，吉林 吉林 132101)

結核分枝桿菌不同RNA提取方法的對比

譚 陽，尹 銳，徐亞維

(吉林農業科技學院生物工程學院，吉林 吉林 132101)

分別采用玻璃珠處理法、超聲破碎和甲醇裂解法對結核菌細胞壁處理后進行提取。結果表明：甲醇裂解法提取的RNA濃度和純度較高，完整性也最好。玻璃株法次之，超聲波法有降解。雖然三種方法提取的RNA都能直接用于下一步實驗操作，但甲醇裂解法效果更好。

結核桿菌；RNA；提取

結核桿菌是引起人畜共患傳染病結核病的主要病原菌，可通過空氣和畜產品等途徑傳給人或其他動物，尤其是牛結核病不但會給畜牧業帶來嚴重影響，也威脅人類健康[1]。由于傳統檢測結核病診斷方法的局限性，不利于快速準確地診斷肺結核及其療效，急需開發快速準確的檢測方法[2]。

近年來，分子診斷技術為結核桿菌檢測開辟了一條新路，如環介導恒溫擴增檢測技術、RNA恒溫擴增技術、基因芯片技術等。但這些技術的應用都是以獲得高質量結核桿菌的DNA和RNA為前提，而結核分枝桿菌的mRNA半衰期極短，細胞壁脂質含量又很高且細胞壁裂解困難，這些加大了結核分枝桿菌RNA提取的難度[3]。本研究分別采用玻璃珠處理法、超聲破碎法和甲醇裂解法對結核菌細胞壁處理后進行提取，探討三種方法對結核分枝桿菌RNA提取的效果，以期獲得一種簡單、高效的結核分枝桿菌RNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

結核分枝桿菌H37Rv標準株(吉林市結核病防治研究所)；Trizol試劑(Invitrogen)；直徑0.5mm玻璃珠(美國Sigma)。

1.2 試驗方法

1.2.1 結核分枝桿菌菌懸液的制備

取H37Rv標準株，接種于改良羅氏培養基，37℃培養28～42d[4]。稱取9份濕重約30mg的H37Rv標本，分別標記為玻璃珠法、超聲波法和甲醇裂解法，每組設三個平行對照。

1.2.2 結核分枝桿菌總RNA的提取前處理

各加入1 mL Trizol 后渦旋振蕩混勻，分別用三種破壁方法進行前處理。玻珠法加玻珠0.2 g，靜止5 min；超聲波法先-80℃放置10 min，沸水速融后240 W超聲波處理3次，每次3 min，間歇15 s；分別加入200 μL氯仿，渦旋振蕩1 min，冰置10 min。甲醇裂解法加入1 mL新配置的氯仿甲醇溶液(氯仿∶甲醇=3∶1)，渦旋振蕩1 min，冰置10 min[5]。

1.2.3 結核分枝桿菌總RNA的提取

4℃，12 000×g離心15 min，取上層水相加入等量的異丙醇混勻，-20℃靜置1 h。4℃，10 000×g離心10 min棄上請，70%乙醇洗2次，干燥后加DEPC水溶解。

1.2.4 結核分枝桿菌總RNA鑒定

取5 μL RNA樣品進行1%的變性瓊脂糖凝膠檢測，判斷RNA的完整性；并取1.5 μLRNA樣品用快速微量紫外測定儀測定RNA的濃度和純度。

2 結果與討論

2.1 結核分枝桿菌RNA的濃度和純度檢測

由表1可知，三種方法均能獲得一定濃度的RNA。其中甲醇裂解法提取的RNA濃度最高，為115.05 ng/μL，其OD260/280值甲醇裂解法最好，在1.9～2.0，OD260/230在2.0～2.3，說明此法提取的樣品中，蛋白質、鹽類等基本去除干凈。其次為玻璃珠法，超聲波法提取的RNA濃度最低，可能是產生了熱量影響了RNA得率。

表1 三種方法提取結核分枝桿菌總RNA濃度和純度測定Tab.1 Three extraction methods on total RNA concentration and purity determination from mycobacterium tuberculosis

2.2 結核分枝桿菌RNA的完整性檢測

采用1%變性瓊脂糖凝膠電泳對提取的結核分枝桿菌RNA進行完整性檢測，圖1中三種方法均看到了23SrRNA、16SrRNA和5SrRNA三條帶，但超聲法中條帶發生彌散現象，說明高熱量導致RNA降解；而甲醇裂解法條帶更明亮清晰，且23S近乎16S條帶濃度的2倍，說明RNA較完整，無降解現象。玻璃珠法雖不如甲醇法好，但也可用于結核桿菌RNA的提取。

Lane 1: 甲醇裂解法；Lane 2:玻璃珠法；Lane 3:超聲波法 Lane 1: methanolysis method; Lane 2: glass bead method; Lane 3: ultrasonic disruption圖1 三種方法提取的結核分枝桿菌RNA完整性比較Fig.1 Comparison of the RNA integrity of mycobacterium tuberculosis extracted by three methods

3 結論

結核分枝桿菌由于其細胞壁脂質含量高，很難像其他細菌細胞一樣用通用的裂解劑將結核分枝桿菌細胞快速裂解。本研究采用三種方法處理結核分枝桿菌細胞壁，并用Trizol進行 RNA提取，結果超聲波法由于產生較大熱量影響了RNA得率和完整性，玻璃珠法雖不如甲醇裂解法好，但避免了甲醇的毒性。甲醇裂解細胞壁法提取的結核分枝桿菌RNA 的得率明顯高于其他兩種方法，因為甲醇能迅速溶解脂質，瞬間穿透并破壞結核分枝桿菌的脂質細胞壁，使細胞質中的RNA釋放[3]。因此，甲醇裂解法和玻璃珠法均可以用于RNA的提取，但甲醇裂解法更好。

[1] Shamim Akhtar，Sampa Sarkar，Abhishek Mishra，Dhiman Sarkar. A method to extract intact and pure RNA from mycobacteria[J]. Analytical Biochemistry，2011，(417)：286-288.

[2] M.D. Bashyam，A.K. Tyagi. An efficient and high yielding method for isolation of RNA from mycobacteria[J]. Biotechniques，1994，(17)：834-836.

[3] 賈紅彥，李自慧，杜博平，等.結核分枝桿菌總RNA提取方法的比較研究[J].臨床肺科雜志，2012，17(7)：1246-1248.

[4] 羅影殊，高文鳳，黃偌穎，等.不同破壁方法提取結核分枝桿菌總RNA的比較[J].中國防癆雜志，2013，35(3)：183-186.

[5] 俞埡美，王姍姍，褚麗花，等.適用于結核分枝桿菌RNA抽提的實驗方法學研究[J].臨床肺科雜志，2016，21(4)：609-612.

Comparison of different methods of RNA isolation from mycobacterium tuberculosis

TAN Yang, YIN Rui, XU Ya-wei

(School of Bioengineering, Jilin Agricultural Science and Technology College, Jilin 132101, China)

The cell wall ofmycobacteriumtuberculosiswas extracted by glass bead treatment, ultrasonic disruption and methanolysis method respectively. The results showed that the concentration and purity of RNA extracted by methanolysis method was higher and the integrity was the best. Glass bead method was the second and ultrasonic method has the appearance of degradation. Although the three methods of RNA extraction can be directly used in the next step of the experimental operation, methanolysis method is better.

Mycobacteriumtuberculosis; RNA; Extraction

2016-09-15

吉林省科技廳自然科學基金項目(20140101021JC)；微生物學校級重點學科項目(吉農院合字2015第012號)；大學生科技創新項目(吉農院合字2014第023號)

譚陽(1992-)，女，學士。

徐亞維(1974-)，女，副教授，博士，e-mail：xuyaweilucky@163.com。

R446.5

B

1674-8646(2016)23-0016-02