癌超甲基化基因1與卵巢癌基因1在卵巢癌組織中的表達及意義

王偉源，程文德，李彥華

（廣東省深圳市龍華新區中心醫院 病理科，廣東 深圳 518110）

卵巢癌為婦科常見惡性腫瘤之一，多見于中老年婦女[1]。通常卵巢癌發病較為隱匿，且尚無早期診斷的有效方法，病死率較高，對患者生命安全存在嚴重威脅，因此研究卵巢癌發病機制勢在必行[2]。當今分子生物學不斷發展，發現候選抑癌基因的生物學特征及功能在卵巢癌發病機制中起到一定作用。本組研究旨在探究癌超甲基化基因1（hypermethylated in cancer 1, HIC1）及卵巢癌基因1（ovarian cancer gene 1, OVCA1）蛋白在卵巢癌組織中的表達及意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年-2015年于本院治療的35例卵巢癌患者，年齡31～68歲，平均（46.5±4.8）歲，病理類型：20例漿液性囊腺癌，8例黏液性囊腺癌，7例子宮內膜樣癌；分級：6例高分化，15例中分化，14例低分化；分期：23例臨床I、II期，12例III、IV期。且選擇同期20例交界性卵巢腫瘤患者，年齡28～66歲，平均（46.4±4.6）歲；20例良性卵巢腫瘤，年齡30～65歲，平均（45.9±4.6）歲；20例卵巢組織正常者，年齡31～62歲，平均（46.0±4.4）歲。4組年齡資料比較差異無統計學意義（F=0.098，P=0.961），具有可比性。

1.2 檢測方法

1.2.1 組織處理 ①采用2.0～2.5 cm2×0.2 cm卵巢石蠟組織，均由病理醫生行病理鑒定并圈出腫瘤區域；②采用一次性解剖刀于組織片中刮取石蠟組織至離心管內，離心參數：10 000 r/min，持續5 min，在4℃下進行；③經吐溫20釋放使DNA從細胞核內釋放，蛋白酶K消化組蛋白，消化裂解過夜，至少重復加入2次4 μl 10 mg/ml蛋白酶K，每次間隔超過1 h；④離心后將吸取石蠟層下溶液；⑤采用QIAgen吸附柱收集；⑥冷卻后保存。

1.2.2 凝膠配制與電泳 ①將8%分離膠灌入安裝好的玻璃膠膜內，采用去離子水封閉后使其自然凝固；②待分離膠凝固好且去離子水倒掉后，將8%濃縮膠灌入，插入樣梳；③將膠膜放進電泳槽內加電極緩沖液，取出樣梳，加marker與樣品，50 μg上樣量；④保持電泳儀300 mA、65 V，25 min預電泳；樣品進入分離膠后保持電壓120 V，電泳60 min。

1.2.3 轉膜 ①電泳后轉移凝膠上蛋白至硝酸纖維膜中；②以5%胎牛血清封閉硝酸纖維素膜（nitrocellulose filter membrane，簡稱NC膜），1 h后棄封閉液并加入一抗；③1∶200鼠抗人OVCA1多克隆抗體及1∶100鼠抗人HIC1多克隆抗體于4℃過夜；④含吐溫20的三烴甲基氨基甲烷鹽緩沖液（Tris-Buffered Saline+ Tween 20, TBST）洗膜2、3次，分別加入二抗，即1∶2 000羊抗鼠，室溫下搖晃1 h采用TBST洗膜2、3次；⑤將NC膜放置于配制好的二氨基聯苯胺顯色液內，當條帶完成顯色后，水終止顯色。

1.3 結果判斷方法

①經Western檢測HIC1與OVCA1分別以76KD與50KD呈單一顯色條帶為陽性。經Bandscan軟件進行顯像條帶灰度分析，參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）觀察OVCA1、HIC1表達程度；②臨床病理分期：僅卵巢中存在腫瘤為I期；腫瘤蔓延到盆腔為II期；腫瘤侵犯腹腔臟器為III期；腫瘤超過腹腔為IV期；③參照WHO2003分類標準，進行組織學分型與病理分級。

1.4 統計學方法

選用統計學軟件SPSS 19.0對數據進行處理。計量資料以均數±標準差（±s）表示；兩組間比較用t檢驗；兩兩均數比較用q檢驗；多組均數間比較采用方差分析（F檢驗），P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同卵巢組織中HIC1蛋白表達量比較

在HIC1蛋白表達量方面，組間比較具有統計學差異（P＜0.05），見表1。

表1 不同卵巢組織中HIC1蛋白表達量比較

2.2 不同卵巢組織中OVCA1蛋白表達量比較

在OVCA1蛋白表達量方面，組間比較具有統計學差異（P＜0.05），見表2。

表2 不同卵巢組織中OVCA1蛋白表達量比較

2.3 不同臨床病理特征卵巢癌HIC1表達比較

HIC1蛋白表達量在不同卵巢癌病理類型、病理分級、病理分期中表達差異均無統計學意義（P＞0.05），見表 3。

表3 不同臨床病理特征卵巢癌HIC1表達比較

2.4 不同臨床病理特征卵巢癌OVCA1表達比較

在OVCA1蛋白表達量方面，Ⅲ、Ⅳ期顯著低于Ι、Ⅱ期（P＜0.05）；不同卵巢癌病理分級和病理類型OVCA1蛋白表達量差異無統計學意義（P＞0.05），見表 4。

表4 不同臨床病理特征卵巢癌OVCA1表達比較

3 討論

大量研究證明約占8%卵巢癌具有家族性[3]，其可能與BRCA1或BRCA2基因突變有關。但現在尚未確定散發性卵巢癌發病的分子機制[4]。當今臨床將17號染色體短臂突變作為研究重點，發現17號染色體短臂出現雜合型丟失為卵巢癌患者常見病理改變，而發生雜合性丟失次數最高的區域被指處于17p13.3-p13.2，而對此區域抑癌基因的分析對反映卵巢癌的發病及病理進展具有重要意義，本研究中探討的OVCA1、HIC1基因均位于17號染色體上[5-6]。HIC1蛋白為轉錄抑制物，其同應急控制蛋白經轉錄形成抑制復合體。這種復合物可對應急控制蛋白啟動子進行調控，進而控制轉錄[7]。OVCA1為核內蛋白，可能在細胞分化、增殖、胚胎發育及腫瘤發展中存在一定作用[8-9]。研究顯示，卵巢腫瘤時細胞系內OVCA1蛋白表達水平降低甚至缺損，表明卵巢腫瘤形成過程可能與OVCA1功能缺失緊密相關[10]。

本研究通過分析OVCA1、HIC1基因在不同卵巢組織及不同臨床病理特征卵巢癌組織上的表達發現，在HIC1蛋白表達量方面，組間比較具有統計學差異（P＜0.05）；在OVCA1蛋白表達量方面，組間比較具有統計學差異（P＜0.05）。表明卵巢癌發生與這兩種基因表達水平下調有關。在OVCA1蛋白表達量方面，Ⅲ、Ⅳ期顯著低于Ι、Ⅱ期，表明卵巢癌發展，OVCA1基因丟失顯著增加。HIC1蛋白表達量在不同卵巢癌病理類型、病理分級、病理分期的差異均無統計學意義，推測HIC1基因缺失參與了各種病理類型卵巢癌發生，而卵巢癌的發生和變化機制并不相同，HIC1蛋白失活僅是參與卵巢癌發生的因素之一。

綜上所述，HIC1與OVCA1的基因缺失參與了卵巢癌的發生和發展過程，OVCA1、HIC1可作為卵巢癌發病及病理進展的一種預測因子。

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