維吾爾族與漢族帕金森病患者ATP13A2基因Thr12Met位點突變分析

李桂花，夏 歡，楊新玲

·論著·

維吾爾族與漢族帕金森病患者ATP13A2基因Thr12Met位點突變分析

李桂花，夏 歡，楊新玲

【摘要】目的探討ATP13A2基因Thr12Met位點突變在新疆維吾爾族、漢族帕金森病(PD)患者中是否存在差異。方法選取2012年8月—2015年3月新疆伊犁地區、和田地區、烏魯木齊市流行病學調查中及就診于新疆醫科大學第一附屬醫院的原發性PD患者420例為病例組(包括維吾爾族200例、漢族220例)，同時選取流行病學調查中及就診于新疆醫科大學第一附屬醫院的健康體檢者400例為對照組(包括維吾爾族198例、漢族202例)。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RELP)和基因測序方法對兩組人群進行檢測，分析ATP13A2基因Thr12Met位點突變情況。結果在420例PD患者和400例健康體檢者中，僅出現2例漢族PD患者發生Thr12Met位點雜合變異AG基因型，且2例PD患者均是早發型帕金森病(EOPD)患者，未發現有純合變異AA基因型，維吾爾族病例組和對照組均未發現純合變異AA基因型和雜合變異AG基因型。ATP13A2基因Thr12Met多態性在所有病例組與對照組、維吾爾族病例組與對照組、漢族病例組與對照組、維吾爾族病例組與漢族病例組、EOPD組與晚發型帕金森病(LOPD)組、男病例組與女病例組基因型及等位基因分布間差異均無統計學意義(P>0.05)。結論新疆維吾爾族與漢族ATP13A2基因Thr12Met位點突變率均極低，且Thr12Met位點基因型及等位基因分布間無明顯差異；Thr12Met位點的基因型及等位基因與民族、發病年齡及性別均為無明顯相關性。

【關鍵詞】帕金森病；ATP13A2基因；Thr12Met位點；突變；維吾爾族；漢族

李桂花，夏歡，楊新玲.維吾爾族與漢族帕金森病患者ATP13A2基因Thr12Met位點突變分析[J].中國全科醫學，2016，19(4)：437-441.[www.chinagp.net]

Li GH,Xia H,Yang XL. ATP13A2 gene Thr12Met site mutations of patients with Parkinson′s disease of Uygur and Han ethnic groups[J].Chinese General Practice，2016，19(4)：437-441.

ATP13A2 Gene Thr12Met Site Mutations of Patients With Parkinson′s Disease of Uygur and Han Ethnic GroupsLIGui-hua,XIAHuan,YANGXin-ling.DepartmentofGeneralMedicine,CancerHospitalAffiliatedtoXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the difference in ATP13A2 gene Thr12Met site mutations in patients with Parkinson′s disease (PD) between Uygur ethnic group and Han ethnic group. MethodsFrom August 2012 to March 2015,we enrolled 420 patients (including 200 Uygur people and 220 Han people) with primary PD who received treatment in the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University or were the respondents of the epidemiological investigation in Yili Prefecture,Hotan Prefecture and Urumqi. We also enrolled 400 healthy people (including 198 Uygur people and 202 Han people) who received physical examination in the hospital and were the respondents of the epidemiological investigation in the same period as control group. PCR-RELP and gene sequencing method were employed on both groups. Analysis was made on ATP13A2 gene Thr12Met site mutations. ResultsAmong 420 PD patients and 400 healthy controls,the AG genotype with heterozygous mutation at Thr12Met site was found in 2 PD patients of Han ethnic group. The two patients both had early-onset Parkinson′s disease (EOPD),and no AA genotype with homozygous mutation was found in them. No AA genotype with homozygous mutation or AG genotype with heterozygous mutation was found among Uygur people in case group and healthy controls. In the comparison of genotype and allele distribution,there were no significant differences in Thr12Met polymorphism of ATP13A2 genes between case group and control group,between Uygur patients in case group and Uygur patients in control group,between Han patients in case group and Han patients in control group,between Uygur patients and Han patients in case group,between EOPD group and LOPD group and between male patients in case group and female patients in case group (P>0.05 for all). ConclusionUygur patients and Han patients have low mutation rate at ATP13A2 gene Thr12Met site and have no significant differences in genotype and allele distribution of ATP13A2 gene Thr12Met site. Genotype and allele distribution of Thr12Met site have no obvious correlation with ethnic groups,onset age and gender.

【Key words】Parkinson disease;ATP13A2 genes;Thr12Met site;Mutation;Uygur nationality;Han nationality

ATP13A2基因又名PARK9基因，是目前帕金森病(Parkinson′s disease，PD)基因遺傳發病機制研究的熱點之一[1]。報道顯示ATP13A2基因是PD發病的易患致病基因，在早發型帕金森病(early-onset Parkinson′s disease,EOPD)和家族性PD患者中均可發現 ATP13A2 基因突變[2]。目前研究報道Thr12Met突變類型與EOPD及家族性PD相關[3]。國內外關于Thr12Met突變與EOPD 相關的報道為數不多。因此ATP13A2基因Thr12Met位點的突變與PD的相關性需要進一步深入研究，特別是此基因位點突變特點與不同種族EOPD的相關性及可能機制更需擴大樣本研究。新疆地處中亞，世代居住于該地區的維吾爾族相比漢族具有遺傳背景的差異性，而且國內尚罕見探索不同民族間PD易患性與ATP13A2基因Thr12Met位點多態性及突變相關聯的報道，故本研究在課題組前期工作的基礎上，探討ATP13A2基因位點Thr12Met多態性和突變性與新疆地區維吾爾族和漢族人群散發型帕金森病(sporadic Parkinson′s disease,SPD)發病(尤其是EOPD)的關系以及與臨床癥狀的相關性。

1對象與方法

1.1研究對象選取2012年8月—2015年3月新疆伊犁地區、和田地區、烏魯木齊市流行病學調查中及就診于新疆醫科大學第一附屬醫院的原發性PD患者420例為病例組。納入標準：(1)均符合英國帕金森病協會腦庫(brain bank)臨床診斷標準[4]；(2)均為SPD患者；(3)完成所有調查量表、實驗室檢查項目及臨床基本資料完整；(4)長期生活在新疆地區(2代以上)；(5)未與其他民族通婚的維吾爾族及漢族。排除標準：(1)繼發性帕金森綜合征、帕金森疊加綜合征、家族性帕金森綜合征等患者；(2)伴有各種嚴重器質性疾病患者，如心功能不全、惡性腫瘤、血液病、肝腎疾病者。同時選取流行病學調查中及就診于新疆醫科大學第一附屬醫院的健康體檢者400例為對照組。納入標準：(1)與PD患者生活環境、飲食習慣和受教育程度相似，性別、民族相同，年齡相差不超過5歲；(2)無PD家族史。排除標準：不能確診的疑似PD患者。

1.2研究方法獲得患者知情同意后，抽取外周靜脈血2 ml置于含800 μl乙二醇四乙酸的抗凝管中，使用天根生化(北京)有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，嚴格按照試劑盒配套說明操作書操作。檢驗DNA純度為1.7～1.9，濃度≥10 ng/μl，判為DNA純度合格。樣本-20 ℃保存，備用。引物設計由上海生工公司合成，分別為(Thr12Met位點)上游：PF 5′-CAGGCTGATGTTTATTGTTTTTA-3′(f)，下游：PR 5′-CTCTCACCTCTTTGTCTCTTATT-3′(r)；聚合酶鏈反應(PCR)體系共20 μl： 2×Tap PCR Master Mix 10 μl,10 μmol/ml上下游引物各0.5 μl，100 ng/μl DNA 2 μl，去離子水補至20 μl。PCR反應條件(Thr12Met位點)：94 ℃預變性3 min，經過25個循環(94 ℃變性30 s,57.7 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸7 min，保存于4 ℃，PCR產物為491 bp；將7 μl PCR產物加樣于2%瓊脂糖凝膠中，以120 V電泳30 min，于紫外光凝膠成像儀下觀察是否存在特異性目的片段，將符合特異性長度片段的目的片段采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RELP)方法進行酶切，酶切反應體系總體積20 μl，包括PCR產物10 μl,10 ×緩沖液2 μl,限制性內切酶(10 U/μl)0.5 μl,加雙蒸水至20 μl，將上述物質加入0.2 ml優質滅菌Elmendorf PCR管中，其后放入37 ℃恒溫箱中過夜(需16～24 h)。然后取出進行酶切產物確認，取酶切產物進行聚丙烯凝膠電泳，用紫外線凝膠電泳成像分析系統判斷酶切結果。

2結果

2.1受試者基本情況420例PD患者中，男245例，女175例；維吾爾族200例(男118例、女82例)，漢族220例(男127例、女93例)；≤50歲EOPD 101例(男54例、女47例，維吾爾族52例、漢族49例)，>50歲晚發型帕金森病(LOPD)319例(男191例、女128例，維吾爾族148例、漢族171例)。400例健康體檢者中，男208例，女192例；維吾爾族198例(男102例、女96例)，漢族202例(男106例、女96例)；≤50歲110例(男60例、女50例，維吾爾族59例、漢族51例)，>50歲290例(男148例、女142例，維吾爾族139例、漢族151例)。

2.2TP13A2基因Thr12Met位點PCR、PCR-RELP及測序結果Thr12Met多態位點基因型分為野生GG基因型、純合變異AA基因型和雜合變異AG基因型，在本研究中應用PCR-RELP方法，在420例PD患者和400例健康體檢者中，僅有2例漢族PD患者發生雜合變異AG基因型，且2例PD患者均是EOPD患者；未發現有純合變異AA基因型。維吾爾族PD患者和對照組未均未發現純合變異AA基因型和雜合變異AG基因型。(1)ATP13A2基因Thr12Met位點經PCR 擴增后產物片斷的理論值為491 bp，在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳可顯示該PCR的擴增產物(見圖1)。(2)Thr12Met位點在 NIaIII 酶切后，酶切產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，野生GG基因型顯示330、161 bp兩條帶，雜合變異AG基因型(出現105、161、330 bp三條帶)，未發現純合變異AA基因型(見圖2)。(3)將PCR-RELP酶切后可疑發生變異的基因樣本進行測序驗證，結果顯示SNP位點反向測序，圖中黑色箭頭所指為堿基替換處(上圖為GG基因型，下圖為AG基因型)，從下圖可以看出從左向右堿基序列第7個本來是G的，結果突變成了A，測序結果為雜合變異，雙峰圖(見圖3)。

注：M為DNA標志物；1～7為PCR擴增產物電泳圖；PCR=聚合酶鏈反應

圖1 Thr12Met PCR擴增產物電泳圖

Figure 1Electrophoresis of PCR product of Thr12Met

注：M為DNA標志物；1、4為AG基因型；2、3、5為GG基因型

圖2NIaIII酶切電泳圖

Figure 2Electrophoresis after NIaIII

注：上圖為GG基因型；下圖為AG基因型

圖3Thr12Met位點測序圖

Figure 3Sequence diagram of Thr12Met site

2.3病例組與對照組Thr12Met位點基因型與等位基因分布比較兩組Thr12Met位點基因型及等位基因分布比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表1)。

表1病例組與對照組Thr12Met位點基因型及等位基因分布比較〔n(%)〕

Table 1Comparison of Thr12Met genotype and allele distribution between case group and control group

組別例數基因型GG AA AG等位基因G A對照組400400(100.0)00800(100.0)0病例組420418(99.5)02(0.5)838(99.8)2(0.2)P值0.6750.567

2.4維吾爾族、漢族病例組與對照組Thr12Met位點基因型及等位基因分布比較維吾爾族病例組與對照組Thr12Met位點基因型及等位基因分布間差異無統計學意義(P>0.05)；漢族病例組與對照組Thr12Met位點基因型及等位基因分布間差異無統計學意義(P>0.05)；維吾爾族病例組與漢族病例組Thr12Met位點基因型及等位基因分布間差異無統計學意義(P>0.05，見表2)。

表2維吾爾族、漢族病例組與對照組Thr12Met位點基因型及等位基因分布比較〔n(%)〕

Table 2Comparison of Thr12Met genotype and allele distribution between Uygur and Han patients and healthy controls

組別例數基因型GG AA AG等位基因G A維吾爾族 對照組198198(100.0)00396(100.0)0 病例組200200(100.0)a0a0a400(100.0)a0a P值0.6750.756漢族 對照組202202(100.0)00404(100.0)0 病例組220218(99.1)02(0.9)438(99.5)2(0.5) P值0.7650.564

注：與漢族病例組比較，aP>0.05

2.5不同發病年齡病例組與對照組Thr12Met位點基因型及等位基因分布比較≤50歲病例組與對照組Thr12Met位點基因型及等位基因分布間差異無統計學意義(P>0.05)；>50歲病例組與對照組Thr12Met位點基因型及等位基因分布間差異無統計學意義(P>0.05)；≤50歲病例組與>50歲病例組Thr12Met位點基因型及等位基因分布間差異無統計學意義(P>0.05，見表3)。

2.6不同性別病例組與對照組Thr12Met位點基因型及等位基因分布比較男病例組與對照組Thr12Met位點基因型及等位基因分布間差異無統計學意義(P>0.05)；女病例組與對照組Thr12Met位點基因型及等位基因分布間差異無統計學意義(P>0.05)；男病例組與女病例組Thr12Met位點基因型及等位基因分布間差異無統計學意義(P>0.05，見表4)。

2.7Thr12Met位點不同基因表型(野生GG基因型與雜合變異AG基因型)PD患者臨床資料分析在420例PD患者和400例健康體檢者中，ATP13A2基因Thr12Met位點發生雜合變異AG基因型的僅有2例EOPD患者，這2例EOPD患者的僵硬、震顫等均較為嚴重，野生GG基因型PD患者共418例，由于變異樣本量少，無法得出有統計學意義的結論(見表5)。

3討論

目前已經報道了關于ATP13A2基因位點的不同雜合和純合突變，如Gly504Arg、F182、Thr367Arg等純合突變，以及一些雜合突變Thr12Met、Gly533Arg、Ala746Thr、Ala78Thr等[5]。其中研究報道認為Thr12Met位點突變類型與EOPD及家族性PD相關，Thr12Met雜合突變可能是 EOPD 疾病相關發病因素[6]。

ATP13A2基因位于1號染色體上，共編碼29個外顯子，Thr12Met位于1號染色體上2號外顯子上，Thr12Met多態性位點為G→A轉換，蘇氨酸被甲硫氨酸代替(Thr→Met)。本研究應用PCR-RELP結合測序技術，通過對新疆地區維吾爾族 、漢族 PD患者及健康人群的基因多態性分析，結果提示ATP13A2基因Thr12Met多態以野生GG基因型多見，僅發現2例PD患者攜帶雜合突變AG基因型，未見純合突變AA基因型。Crosiers等[7]在兩個發病年齡分別為30、40歲的意大利SPD患者中各發現一個雜合突變Thr12Met和Gly533Arg，在一個來自巴西的發病年齡為12歲的散發帕金森綜合征患者中發現了ATP13A2基因的1個GlyS04Arg純合突變。在本研究中亦發現了Thr12Met雜合突變，與既往國外研究結果基本一致。

表3不同發病年齡病例組與對照組Thr12Met位點基因型及等位基因分布比較〔n(%)〕

Table 3Comparison of Thr12Met genotype and allele distribution between case group and control group in two different age ranges

年齡例數基因型GG AA AG 等位基因G A≤50歲 對照組110110(100.0) 0 0220(100.0)0 病例組10199(98.0)a0a2(2.0)a200(99.0)a2(1.0)a P值0.5430.654>50歲 對照組290290(100.0)00580(100.0)0 病例組319319(100.0)00638(100.0)0 P值0.6750.765

注：>50歲病例組比較，aP>0.05

表4不同性別病例組與對照組Thr12Met位點基因型及等位基因分布比較〔n(%)〕

Table 4Comparison of Thr12Met genotype and allele distribution between case group and control group of different genders

組別例數基因型GG AA AG 等位基因G A男 對照組208208(100.0)00416(100.0)0 病例組245244(99.6)a0a1(0.4)a489(99.8)a1(0.2)a P值0.7650.675女 對照組192192(100.0)00384(100.0)0 病例組175174(99.4)01(0.6)349(99.7)1(0.3)P值0.5640.786

注：與女病例組比較，aP>0.05

表5　Thr12Met多態位點不同基因表型PD患者臨床資料分析

注：a為400例PD患者中共有293例服用過美多巴，AG基因型2例反應良好；GG基因型271例良好，20例欠佳；EOPD=早發型帕金森病，LOPD=晚發型帕金森病，UPDRS-I,II,III=帕金森病評分量，H-Y分級=Hoehn-Yahr分級

本研究中Thr12Met位點發生雜合變異AG基因型均見于EOPD患者中，在LOPD患者中未發現任何突變，本研究同時發現出現AG基因型變異的PD患者僵硬、震顫程度均較為嚴重，但由于變異樣本量少，與野生GG基因型的PD患者無法做比較，故在今后研究中仍需繼續擴大樣本量，以期得出有統計學意義的相關性結論。Thr12Met位點突變在本研究SPD患者中發病率為0.48%，與既往研究報道基本一致[8]。但目前國內外仍缺乏大量關于Thr12Met位點突變的相關報道，Thr12Met位點突變與PD發病，尤其是與EOPD患者發病相關性仍需課題組今后擴大樣本量進一步研究。

雖然新疆的維吾爾族具有歐洲人和蒙古人的血統，有著與漢族人種不同的遺傳背景，但是通過比較ATP13A2基因Thr12Met位點的基因型和等位基因分布發現在新疆的維吾爾族與漢族兩民族PD患者中差異不明顯，維吾爾族病例組及漢族病例組分別與其相應民族的對照組多態位點基因型和等位基因頻率分布比較差異亦不明顯，提示該基因的多態位點在這兩個民族PD患者間可能存在較小的差異性。男病例組及女病例組與相應性別的對照組基因型及等位基因頻率分布比較差異不明顯，表明ATP13A2基因Thr12Met多態性可能與性別無關。按年齡分組比較，本研究表明在≤50歲病例組及>50歲病例組與相應年齡的對照組間差異均不明顯，與Mao等[3]的研究結果“好發于EOPD患者”有所不同。

總之，有明確遺傳基因傾向的家族性PD僅占10%～15%，占絕大數量的SPD病因仍不明確，事實上，在過去的幾十年里有多篇報道提出并爭論具有SPD發病風險的基因位點，分析得出多數多態與散發性PD很少或沒有明顯相關性，提示該疾病可能需要更大規模，非偏倚的基因檢測方法。部分報道結果無法重復，也可能導致假陽性或假陰性結果。因此，只有不斷擴大試驗樣本量，重復檢測結果，才能找出真正與PD發病相關的易感基因多態及突變位點。

作者貢獻：李桂花主要進行試驗的實施，資料收集及論文的撰寫、成文并對文章負責；夏歡進行資料收集，試驗實施；楊新玲進行試驗設計，質量控制與審校、評估。

本文無利益沖突。

參考文獻

[1]Ning YP,Kanai K,Tomiyama H,et al. PARK9-linked parkinsonism in eastern Asia: mutation detection in ATP13A2 and clinical phenotype[J]. Neurology,2008,70 (12):1491-1493.

[2]Park JS,Mehta P,Cooper AA,et al. Pathogenic effects of novel mutations in the P-type ATPase ATP13A2(PARK9) causing Kufor-Rakeb syndrome,a form of early-onset parkinsonism[J].Hum Mutat,2011,32(8):956-964.

[3]Mao XY,Burgunder JM,Zhang ZJ,et al. ATP13A2 G2236A variant is rare in patients with early-onset Parkinson′s disease and familial Parkinson′s disease from Mainland China[J]. Parkinsonism Relat Disord,2010,16(3):235-236.

[4]Hughes AJ,Daniel SE,Kilford L,et al. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson′s disease: a clinico-pathological study of 100 cases[J].J Neurol Neurosurg Psychiatry,1992,55(3):181-184.

[5]Xiromerisiou G,Dardiotis E,Tsimourtou V,et al. Genetic basis of Parkinson disease[J]. Neurosurg Focus,2010,34(4):28-29.

[6]Martin I,Dawson VL,Dawson TM. The impact of genetic research on our understanding of Parkinson′s disease[J]. Prog Brain Res,2010,183(1):21-24.

[7]Crosiers D,Ceulemans B,Meeus B,et al.Juvenile dystonia-parkinsonism and dementia caused by a novel ATP13A2 frameshift mutation[J]. Parkinsonism Relat Disord,2011,17(3):135-138.

[8]Di Fonzo A,Chien HF,Socal M,et al. ATP13A2 missense mutations in juvenile parkinsonism and young onset Parkinson disease[J]. Neurology,2007,68(19):1557-1562.

(本文編輯：崔沙沙)

(收稿日期：2015-09-12；修回日期：2015-12-28)

【中圖分類號】R 741

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.04.016

通信作者：楊新玲，830000新疆烏魯木齊市，新疆醫科大學附屬腫瘤醫院綜合內科；E-mail：poplar862@sohu.com

基金項目：新疆維吾爾自治區自然科學基金資助面上項目(2014211C106) ——ATP13A2基因亞型Ala746Thr和Thr12Met突變類型與新疆維吾爾族早發型帕金森病的相關性研究
作者單位：830000新疆烏魯木齊市，新疆醫科大學附屬腫瘤醫院綜合內科(李桂花，夏歡，楊新玲)；新疆醫科大學附屬中醫院腦病二科(李桂花)