ACE、AGT、eNOS基因多態(tài)性與特發(fā)性膜性腎病的相關(guān)性研究

郭玉，熱孜萬·阿不都拉，趙宗峰，陸晨

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院腎病科1、中心實驗室2，新疆 烏魯木齊 830001)

ACE、AGT、eNOS基因多態(tài)性與特發(fā)性膜性腎病的相關(guān)性研究

郭玉1，熱孜萬·阿不都拉1，趙宗峰2，陸晨1

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院腎病科1、中心實驗室2，新疆 烏魯木齊 830001)

目的 探討血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)、血管緊張素原(AGT)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因多態(tài)性與特發(fā)性膜性腎病(IMN)相關(guān)性。方法選取2011年6月至2015年5月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院經(jīng)腎臟病理和臨床資料綜合確診的45例維吾爾族IMN患者為IMN組，45例維吾爾族IgA腎病患者為IgAN組，45例維吾爾族健康體檢者為健康對照，采用直接測序方法檢測ACE I/D、AGT M235T、eNOS G894T位點單核苷酸多態(tài)性(SNP)。結(jié)果IMN組ACE DD基因型和D等位基因頻率分別為26.7%和56.7%，均高于IgAN組的20.0%和40.0%，D等位基因差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；IgAN組eNOS GG基因型和G等位基因的頻率分別為62.2%，75.6%，均高于健康對照組的26.7%和50.0%，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；ACE DD基因型的患者24 h蛋白尿(2.99±1.48)g明顯高于ACE II基因型(1.57±1.26)g的患者，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，ACE DD基因型的患者血尿(225.25±225.10)萬/ml顯著高于ACE ID基因型(86.33±141.13)萬/ml的患者，兩組差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；AGT CC基因型的患者血清肌酐(164.53±105.95)μmol/L明顯高于AGT TC基因型(99.03±64.11)μmol/L的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；eNOS GG基因型的患者血清肌酐(172.70±114.73)μmol/L明顯高于eNOS GT基因型(97.93±47.12)μmol/L患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論ACE/AGT/eNOS不是新疆維吾爾族IMN患者的易感基因，但與IMN的進展相關(guān)。

特發(fā)性膜性腎病；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶；血管緊張素原；內(nèi)皮型一氧化氮合酶；單核苷酸多態(tài)性

在腎小球疾病的易感性和預(yù)后研究中，遺傳因素一直占據(jù)著重要地位[1-3]。特發(fā)性膜性腎病(Idiopathic membranous nephropathy，IMN)是成人原發(fā)性腎小球疾病最常見的類型之一。發(fā)病機制尚不明確，確證只能依靠腎臟病理活檢。目前認為抗體結(jié)合到足細胞的靶抗原上形成免疫沉積物激活了補體系統(tǒng)，導(dǎo)致足細胞受損是IMN發(fā)病的主要原因。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大量學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)IMN的發(fā)病與基因有關(guān)，遺傳因素在IMN的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[4-8]。本研究探討血管緊張素原(Angioten-sinogen，AGT)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin-converting enzyme，ACE)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Endothelial ni-tricoxide synthase，eNOS)基因多態(tài)性在新疆維吾爾族IMN發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 2011年6月至2015年5月就診于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院腎病科患者中，經(jīng)腎臟病理活檢確診為IMN的維吾爾族患者45例(IMN組)，其中男性27例、女性18例，年齡23～73歲，平均(39.44±12.99)歲，除外感染(乙肝病毒感染、丙肝病毒感染、HIV感染)、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、藥物、家族性及代謝性等繼發(fā)性因素所引起的繼發(fā)性膜性腎病。疾病對照組45例，取自同期住院經(jīng)腎活檢確診的維吾爾族IgA腎病的患者(IgAN組)，其中男性23例、女性22例，年齡18～67歲，平均(42.89±12.29)歲，除外過敏性紫癜、肝硬化、以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等因素所引起的繼發(fā)性IgA腎病。健康對照組來自維吾爾族健康體檢者，其中其中男性27例、女性18例，年齡23～84歲，平均(48.89±14.79)歲。所有IMN患者均行血清白蛋白(Alb)、血清總膽固醇(TC)、Scr、24 h尿蛋白量、估算的腎小球濾過率(eGFR)等實驗室檢查，同時記錄每例IMN患者的年齡、性別、身高、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、血壓等指標。

1.2 ACE、AGT、eNOS基因多態(tài)性檢測

1.2.1 人全血基因組DNA提取 抽取外周靜脈血5 ml，注入含EDTA的抗凝管，保存于-80℃的冰箱。采用北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司提供的全血基因組DNA提取試劑盒，按照說明書，提取全血DNA，使用紫外分光光度計測定吸光度A260nm/A280nm，所有提取的DNA純度均在1.80以上，置于-20℃冰箱保存。

1.2.2 選用Primer5.0設(shè)計軟件設(shè)計本試驗上下游引物，見表1。由上海生工生物公司合成引物。由北京鼎國生物公司提供的即用型PCR擴增試劑盒，擴增反應(yīng)在美國BIO-RAD公司生產(chǎn)的Bio-Rad型擴增儀上進行。擴增條件：95℃預(yù)變性5 min；主循環(huán)條件：95℃45 s，56.5℃1 min，72℃45 s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。將PCR擴增產(chǎn)物5 μL加入預(yù)先加有Gengreen核酸染料的2%瓊脂糖凝膠中電泳(電壓180 V，時間20 min)采用紫外透射凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶分布況，拍攝數(shù)碼照片分類保存。將擴增的PCR產(chǎn)物送北京鼎國生物公司純化并測序，采用Chromas軟件打開的測序結(jié)果圖像后，確定每個SNP位點的基因型。

SNP位點ACE I/D AGT M235T eNOS G894T引物序列正向：CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT反向：GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT正向：CCGTTTGTGCAGGGCCTG反向：TGCTGTCCACACTGGACCCC正向：AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA反向：CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標準差(±s)表示，計數(shù)資料采用頻數(shù)及百分比表示，計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料及率的比較采用χ2檢驗。計算各組ACE、AGT、eNOS基因型及等位基因頻率，并行Hardy-Weinberg平衡檢驗。采用Logistic回歸分析各基因位點與IMN的相關(guān)性，基因型風險以O(shè)R及95%CI表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ACE I/D多態(tài)性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 ACE I/D多態(tài)性有3種基因型，插入純合子：II，缺失純合子：DD，雜合子：ID。II基因型有490 bp 1個條帶，DD基因型有190 bp 1個條帶，ID基因型有490 bp和190 bp 2個條帶，見圖1。

圖1 ACE I/D多態(tài)性電泳結(jié)果

2.2 基因測序結(jié)果 AGT M235T基因存在T/C多態(tài)性，測序后可見2種基因型CC、CT，未見到TT基因型，見圖2。eNOS G894T基因存在G/T突變，測序后可見3種基因型GG、GT、TT，見圖3。

圖2 AGT M235T基因多態(tài)性

2.3 基因分布平衡檢驗 對ACE、AGT、eNOS基因型的分布行Hardy-Weinberg平衡檢驗，符合遺傳定律(P＞0.05)，具有群體的代表性。

圖3 eNOS G894T基因多態(tài)性

2.4 ACE、AGT、eNOS基因在三組之間分布的比較 IMN組ACE DD基因型和D等位基因頻率分別為26.7%和56.7%，均高于IgAN組的20.0%和40.0%，DD基因型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.559，P= 0.455)，D等位基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.006，P=0.025)；與健康對照組，兩組的DD基因型和D等位基因頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.476，P=0.490，χ2= 0.202，P=0.653)；IgAN組與健康對照組相比較，兩組的基因型和等位基因頻率差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與IgAN組比較，IMN組AGT基因型和等位基因頻率的分布無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.045，P=0.823，χ2= 0.033，P=0.856)；與健康對照組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.741，P=0.389，χ2=0.556，P=0.456)；IgAN組與健康對照組比較，兩組的基因型和等位基因頻率差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與IgAN組比較，IMN組eNOS GG基因型和G等位基因頻率的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.195，P=0.138，χ2=3.168，P=0.075)；與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.876，P=0.050，χ2=3.258，P=0.071)；IgAN組與健康對照組比較，IgAN組GG基因型和G等位基因的頻率(62.2%，75.6%)高于健康對照組(26.7%，50%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 11.520，P=0.001，χ2=12.577，P＜0.0001)，見表2、表3。

表2 IMN組與IgAN組ACE、AGT、eNOS基因多態(tài)性比較[例(%)]

表3 IMN組、IgAN組與對照組ACE、AGT、eNOS基因多態(tài)性比較[例(%)]

2.5 IMN組ACE、AGT、eNOS基因多態(tài)性與臨床表型關(guān)系 ACE DD基因型的患者24 h蛋白尿(2.99±1.48)g明顯高于ACE II基因型(1.57±1.26)g的患者，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.031)；ACE DD基因型的患者血尿(225.25±225.10)萬/mL顯著高于ACE ID基因型(86.33±141.13)萬/mL的患者，兩組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.015)，ACE DD基因型與II基因型相比，血尿的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；ACE DD基因型的患者血清肌酐(169.46±125.55)μmol/L高于ACE II基因型(117.06±53.35)μmol/L患者，但兩組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表4。AGT CC基因型的患者血清肌酐(164.53±105.95)μmol/L顯著高于AGT TC基因型(99.03±64.11)μmol/L的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P= 0.014)；24 h蛋白尿、血尿在CC基因型與TC基因型的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表5。eNOS GG基因型的患者血清肌酐(172.70±114.73)μmol/L顯著高于eNOS GT基因型(97.93±47.12)μmol/L患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.041)，eNOS GG基因型與TT基因比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；24 h蛋白尿、血尿在GG基因型與GT基因型的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表6。

表4 IMN組ACE基因多態(tài)性與臨床表型關(guān)系(±s)

表4 IMN組ACE基因多態(tài)性與臨床表型關(guān)系(±s)

注：與ACE II比較，aP=0.019，bP=0.027；與ACE ID比較，cP=0.015。

基因型 性別 年齡(歲)24 h蛋白尿(g)24 h蛋白尿(g)血尿(萬/ml)肌酐(μmol/L) ACE II ACE ID ACE DD檢驗值P值9 5男3 1女3 8 7 χ2=3.14 0.208 37.33±12.08 41.59±13.34 35.67±12.60 F=0.954 0.393 1.57±1.26 1.95±1.11a2.99±1.48bF=3.781 0.031 1.57±1.26 1.95±1.11a2.99±1.48bF=3.781 0.031 86.33±141.13 79.81±138.41 225.25±225.10cF=3.33 0.045 117.06±53.35 124.37±84.99 169.46±125.55 F=1.074 0.351

表5 IMN組AGT基因多態(tài)性與臨床表型關(guān)系(±s)

表5 IMN組AGT基因多態(tài)性與臨床表型關(guān)系(±s)

基因型 性別 年齡(歲)24 h蛋白尿(g)血尿(萬/ml)肌酐(μmol/L) AGT TT AGT TC AGT CC檢驗值P值男0 1 0女0 1 0 0 0 0 17 0 8 χ2=1.50 0.221 36.88±12.70 42.65±12.94 t=2.256 0.140 1.76±1.03 2.51±1.43 t=1.973 0.055 141.36±177.67 92.10±170.73 0.940 0.352 99.03±64.11 164.53±105.95 t=2.56 0.014

表6 IMN組eNOS基因多態(tài)性與臨床表型關(guān)系(±s)

表6 IMN組eNOS基因多態(tài)性與臨床表型關(guān)系(±s)

注：與eNOS GT比較，aP=0.018。

基因型年齡(歲)24 h蛋白尿(g)血尿(萬/ml)性別男14肌酐(μmol/L) eNOS GG eNOS GT eNOS TT檢驗值P值9 4女7 6 5 χ2=4.388 0.111 38.57±11.21 40.73±14.41 39.33±15.66 F=0.117 0.890 2.55±1.22 1.80±1.52 1.90±0.98 F=1.732 0.189 143.67±185.25 117.40±200.90 66.44±78.53 F=0.608 0.549 172.70±114.73a97.93±47.12 110.90±75.12 F=3.44 0.041

3 討 論

特發(fā)性膜性腎病(IMN)目前認為是由于人體內(nèi)產(chǎn)生了針對腎小球臟層上皮細胞膜成分的自身抗體，抗原抗體結(jié)合形成原位或循環(huán)免疫復(fù)合物，沿腎小球基底膜沉積，導(dǎo)致腎小球濾過屏障受損，進而出現(xiàn)蛋白尿，因此認為IMN是一種自身免疫性疾病[9]。近年來，一些研究發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性與IMN的發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，但是基因多態(tài)性與自身抗體及沉積物之間的聯(lián)系尚未明了。目前認為，環(huán)境和遺傳因素影響疾病的發(fā)展和預(yù)后[10-12]。

RAS系統(tǒng)在腎臟疾病、心血管疾病和糖尿病的發(fā)展中起著重要的作用[13-15]。而AGT、ACE是RAS的核心組成部分，研究發(fā)現(xiàn)RAS核心組成部分的單核苷酸多態(tài)性與腎臟疾病的進展和預(yù)后有關(guān)[16]。

ACE基因位于染色體17q23，長21 kb，由26個外顯和25個內(nèi)含子組成，其第16內(nèi)含子由于插入或缺失1個287 bp的DNA片段而表現(xiàn)為I/D多態(tài)性[17]。ACE是一種鋅金屬肽酶，催化血管緊張素I轉(zhuǎn)化成血管緊張素II，是RAS系統(tǒng)最為重要的組成部分[18]。血管緊張素II水平增高，改變腎臟血流動力學(xué)，各種細胞因子和生長因子表達增加，系膜細胞增生，系膜基質(zhì)增加，腎小球囊內(nèi)壓增高，致使腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化，從而影響腎功能[2]。ACE I/D基因多態(tài)性在IgA腎病的研究較多，一項meta分析的研究發(fā)現(xiàn)，DD基因型和D等位基因是亞洲IgA腎病患者的易感基因型，與歐美人IgA腎病發(fā)病無關(guān)，DD基因型和D等位基因與亞洲、歐美人的IgA腎病進展無關(guān)[19]。

人類AGT基因，長13 kb，位于1號染色體q42-43，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成。其第二外顯子區(qū)的T/C錯義突變，導(dǎo)致編碼產(chǎn)物第235位氨基酸由甲硫氨酸突變?yōu)樘K氨酸，即M235T。一項meta分析的研究發(fā)現(xiàn)AGT M235T多態(tài)性與漢族人群冠狀動脈疾病的易感性相關(guān)[20]。Masanori等[21]研究發(fā)現(xiàn)與微小病變性腎小球疾病相比，IgA腎病患者AGT蛋白在腎小球內(nèi)皮細胞和系膜細胞高表達，且腎小球AGT蛋白的水平與血管緊張素、轉(zhuǎn)化生長因子、腎小球細胞數(shù)量和腎小球硬化相關(guān)。因此，RAS系統(tǒng)與腎臟疾病和腎小球損傷程度相關(guān)[22]。

與前兩個基因相比，eNOS的研究較少。eNOS基因位于染色體7q35～36，有26個外顯子和25個內(nèi)含子，長21 kb。其編碼的一氧化氮合酶是血管壁NO基礎(chǔ)水平的關(guān)鍵酶，第7外顯子的G894T的替換可導(dǎo)致所編碼的第298位的谷氨酸被天冬氨酸替換，影響編碼的eNOS活性，進而影響一氧化氮(NO)合成。NO是一種內(nèi)皮源性的舒張因子，在血管擴張、血管平滑肌舒張、抑制內(nèi)皮細胞增殖以及調(diào)節(jié)腎臟血流動力學(xué)等方面起著重要作用。

Zhu等[23]研究了ACE/AGT/eNOS的基因多態(tài)性與IgAN、IMN的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)ACE、AGT和eNOS基因均與IgA腎病腎功能衰竭的發(fā)展有關(guān)，而ACE和eNOS基因與IMN患者蛋白尿的程度和腎功能衰竭的發(fā)展相關(guān)聯(lián)。本研究對象為新疆維吾爾族IMN患者，發(fā)現(xiàn)IMN組ACE基因DD基因型和D等位基因的頻率顯著高于IgA腎病組和健康對照組，而IgA腎病組和健康對照組兩組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；AGT基因型和等位基因的頻率在三組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；IMN組eNOS基因型和等位基因的頻率與IgAN組和健康對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，IgAN組和健康對照組相比較，GG基因型和G等位基因的頻率高于健康對照組。進一步分析基因型和臨床指標的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ACE DD基因型的患者24 h蛋白尿、尿中紅細胞更高。AGT CC基因型與TC基因型相比，CC基因型的患者24 h蛋白尿、尿中紅細胞更高。eNOS GG基因型的患者血清肌酐更高。這與Zhu等[23]的研究不一致，可能與我們樣本量較少有關(guān)，也有可能與族別、地域等影響因素有關(guān)，需要大量的重復(fù)研究，進一步探討。

綜上所述，ACE/AGT/eNOS基因不是新疆地區(qū)維吾爾族IMN患者的易感基因，但可能是其功能基因，與其臨床表現(xiàn)密切相關(guān)，需要腎病醫(yī)師高度關(guān)注。其中ACE DD基因型的患者血清肌酐、24 h蛋白尿均高于II基因型的患者，AGT CC基因型的患者血清肌酐高于TC基因型的患者，eNOS GG基因型的患者血清肌酐高于GT基因型的患者。本研究是首次對新疆維吾爾族人群的ACE/AGT/eNOS基因進行研究，但在AGT M235T基因僅檢測到了CC、CT，未見到TT基因型，可能受樣本量、實驗條件、儀器精度等多種因素的影響和制約，今后將繼續(xù)擴大樣本量驗證ACE I/D、AGT M235T、eNOS G894T基因多態(tài)性與維吾爾族IMN患者的內(nèi)在聯(lián)系，擬采用多個位點聯(lián)合研究方式，為IMN患者的風險預(yù)測及靶基因的治療提供依據(jù)。

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Association of ACE,AGT,eNOS genes single nucleotide polymorphisms with idiopathic membranous nephropathy.

GUO Yu1,Reziwan·Abudula1,ZHAO Zong-Feng2,LU Chen1.Department of Nephrology1,Clinical Medical Research Center2,People's Hospital of Xinjiang Uyghur Autonomous Region,Urumqi 830001,Xinjiang,CHINA

ObjectiveTo investigate the correlation between angiotensin-converting enzyme(ACE),angioten-sinogen(AGT),endothelial nitricoxide synthase(eNOS)genes single nucleotide polymorphisms(SNP)and idiopathic membranous nephropathy(IMN).MethodsA total of 135 Xinjiang Uygur were included in the final genotyping analysis in our hospital from June 2011 to May 2015.Of these,45 were uygur patients with IMN diagnosed by the kidneys pathology(IMN group),and 45 were uygur patients with immunoglobulin A nephropathy(IgAN group),with 45 of uygur healthy controls(control group).The direct sequencing method was used to detect the SNPs of ACE I/D, AGT M235T,eNOS G894T.ResultsThe frequencies of ACE DD genotype and D allele in IMN group(26.7%and 56.7%,respectively)were significantly higher than those of IgAN group(20.0%and 40.0%,respectively),P＜0.05.The frequencies of eNOS GG genotype and G allele in IgAN group(62.2%and 75.6%,respectively)were significantly higher than those of control group(26.7%and 50.0%,respectively)(P＜0.01).The 24 hour proteinuria of ACE DD genotype patients[(2.99±1.48)g]was significantly higher than that of ACE II genotype patients[(1.57±1.26)g],P＜0.05.Hematuria of ACE DD genotype patients[(225.25±225.10)×104/ml]was significantly higher than that of ACE ID genotype patients[(86.33±141.13)×104/ml],P＜0.01.Serum creatinine in AGT CC genotype patients[(164.53±105.95)μmol/L]was significantly higher than that of AGT TC genotype patients[(99.03±64.11)μmol/L],P＜0.05.Serum creatinine in eNOS GG genotype patients[(172.70±114.73)μmol/L]was significantly higher than that of eNOS GT genotype patients [(97.93±47.12)μmol/L],P＜0.05.ConclusionACE/AGT/eNOS genes are not xinjiang uygur IMN patients susceptibility genes,but these genes have the association with the progress of IMN.

Idiopathic membranous nephropathy;Angiotensin-converting enzyme;Angioten-sinogen;Endothelial nitricoxide synthase;Single nucleotide polymorphism

R692

A

1003—6350（2016）09—1388—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.09.005

2015-12-16)

國家自然科學(xué)基金(編號：81560121)；新疆維吾爾自治區(qū)“十二五”重大科技專項(編號：201230119)；新疆維吾爾自治區(qū)科技成果轉(zhuǎn)化項目(編號：201454135)

陸晨。E-mail：luchen706@163.com