Galectin-9對卵巢癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

潘麗英，黃福海，鐘雪花

(1.深圳市寶安區(qū)沙井人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 深圳 518125；2.深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，廣東 深圳 518106；3深圳市寶安區(qū)沙井人民醫(yī)院臨床醫(yī)學科，廣東 深圳 518125)

Galectin-9對卵巢癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

潘麗英1，黃福海2，鐘雪花3

(1.深圳市寶安區(qū)沙井人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 深圳 518125；2.深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，廣東 深圳 518106；3深圳市寶安區(qū)沙井人民醫(yī)院臨床醫(yī)學科，廣東 深圳 518125)

目的探討半乳糖凝集素-9(Galectin-9)對卵巢癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。方法將不同濃度外源性Galectin-9[0(陰性對照)、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL]加入卵巢癌SKOV3細胞中，培養(yǎng)48 h，Western blot法檢測細胞內(nèi)Galectin-9的表達，MTT法檢測細胞活力，Transwell法檢測細胞遷移及侵襲能力，Western blot檢測基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、MMP9、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關蛋白E-鈣粘蛋白(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)的表達。結(jié)果與陰性對照比較，4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL外源性Galectin-9能顯著提高卵巢癌SKOV3細胞中Galectin-9的表達(P＜0.01)；4 μg/mL、8 μg/ml、16 μg/mL外源性Galectin-9能顯著降低SKOV3細胞活力[(100.00± 7.46)vs(77.92±8.03)、(60.62±6.42)、(47.63±5.41)](P＜0.01)，減少細胞遷移[(99.49±9.63)vs(78.36±8.90)、(65.42±7.32)、(50.31±6.78)]及侵襲數(shù)目[(99.13±10.30)vs(76.69±7.23)、(63.68±6.32)、(52.37±4.99)](P＜0.01)，并能顯著下調(diào)MMP2、MMP9及Vimentin的表達(P＜0.01)，上調(diào)E-cadherin的表達(P＜0.01)。結(jié)論上調(diào)卵巢癌細胞SKOV3中Galectin-9的表達能顯著抑制細胞遷移侵襲等惡性生物學行為，可能與下調(diào)MMPs及調(diào)節(jié)EMT相關蛋白表達有關。

半乳糖凝集素-9；卵巢癌細胞SKOV3；侵襲；轉(zhuǎn)移

卵巢癌是女性生殖器官惡性腫瘤之一，其死亡率居婦科惡性腫瘤首位。作為一種嚴重威脅女性健康和生命的惡性腫瘤，卵巢癌具有發(fā)現(xiàn)晚、轉(zhuǎn)移早、進展快及預后差的特點。而導致卵巢癌死亡率居高不下的主要原因是腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移[1-2]。半乳糖凝集素-9(Galectin-9)是半乳糖結(jié)合蛋白家族的成員之一，能特異性結(jié)合于細胞表面和細胞間質(zhì)中的半乳糖，從而發(fā)揮細胞間及細胞與間質(zhì)間的信號傳遞作用。研究證實Galectin-9與自身免疫性疾病、炎癥、生殖及腫瘤等多種疾病密切相關[3]。此外大量研究報道證實Galectin-9在食管鱗狀細胞癌，乳腺癌、結(jié)直腸癌，胃癌，口腔鱗癌，膠質(zhì)瘤及肝癌中低表達，并與腫瘤的發(fā)生，進展、轉(zhuǎn)移及預后密切相關[4]。本課題組前期研究也證實Galectin-9在卵巢癌組織、癌旁組織，卵巢良性組織中表達逐漸降低，且Galectin-9與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關，提示Galectin-9與卵巢癌的發(fā)生，進展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關，可能成為卵巢癌預后的標志及基因治療的靶點。因此，本研究在此基礎上，探討外源性Galectin-9對卵巢癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移影響的相關機制。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 卵巢癌細胞SKOV3購自中國科學院細胞庫，目錄號TCHu185；兔抗MMP2、MMP9、E-cadherin、Vimentin、GADPH單克隆抗體(Epitmics公司)；兔抗Galectin-9多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；重組人Galectin-9(美國R&D公司)；胎牛血清，DMEM養(yǎng)基(Hyclone公司)；Transwell小室(Corning公司)。迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠)；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；

1.2 方法

1.2.1 MTT法 將卵巢癌細胞SKOV3接種于96孔板培養(yǎng)24 h后，將不同濃度外源性Galectin-9[0(陰性對照)、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL]加入細胞中，培養(yǎng)48 h，加入20 μL的5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μL DMSO，震蕩使結(jié)晶物充分溶解，于酶標儀560 nm處測OD值，細胞相對活力(%)=(Galectin-9組OD值)/(陰性對照OD值)×100%。

1.2.2 遷移實驗 將卵巢癌細胞SKOV3接種于6孔板培養(yǎng)24 h后，將不同濃度外源性Galectin-9[0 (陰性對照)、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL]加入細胞中，培養(yǎng)48 h，細胞消化加入Transwell上室，下室用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，洗滌，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，倒置光學顯微鏡下計數(shù)5個視野穿膜細胞個數(shù)，計算平均每個視野的細胞數(shù)，即表示細胞的侵襲能力。

1.2.3 細胞侵襲實驗 將Matrigel膠均勻平鋪于Transwell小室的微膜(5 μm)上，制成凝膠備用。按1.2.2進行操作，最后倒置光學顯微鏡下計數(shù)5個視野穿膜細胞個數(shù)，計算平均每個視野的細胞數(shù)，即表示細胞的侵襲能力。

1.2.4 Western blot將卵巢癌細胞SKOV3接種于6孔板培養(yǎng)24 h后，將不同濃度外源性Galectin-9[0 (陰性對照)、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL]加入卵巢癌SKOV3細胞中，培養(yǎng)48 h，消化收集細胞，加入RIPA裂解液，每隔10 min置于渦旋儀中震蕩30 s，40 min后，離心，小心吸取上清，即可獲得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒對蛋白濃度進行測定。蛋白上樣，跑SDS凝膠電泳，后濕法轉(zhuǎn)膜。將膜浸入一抗溶液孵育，4℃過夜；漂洗后，浸入二抗溶液中室溫孵育1～2 h。將膜取出漂洗，在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件對各抗體條帶灰度值進行統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 外源性Galectin-9對SKOV3細胞中Galectin-9表達量的影響 如圖1所示，通過Western blot證實，4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL Galectin-9能顯著提高卵巢癌細胞中Galectin-9的表達量(P＜0.01)。

圖1 外源性Galectin-9對SKOV3細胞中Galectin-9表達量的影響

2.2 外源性Galectin-9對卵巢癌細胞SKOV3生物學行為的影響 如表1所示，4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml的Galectin-9能顯著的抑制SKOV3細胞活力，減少細胞遷移及侵襲數(shù)目，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。如表2所示，4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml Galectin-9能顯著下調(diào)SKOV3細胞中MMP2、MMP9及Vimentin的表達，上調(diào)E-cadherin的表達，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表1 外源性Galectin-9對卵巢癌細胞SKOV3生物學行為的影響(±s)

表1 外源性Galectin-9對卵巢癌細胞SKOV3生物學行為的影響(±s)

注：與陰性對照比較，aP＜0.01。

組別 相對細胞活力(%)細胞遷移數(shù)目 細胞侵襲數(shù)目陰性對照4 μg/mL Galectin-9 8 μg/mL Galectin-9 16 μg/mLGalectin-9 100.00±7.46 77.92±8.03a60.62±6.42a47.63±5.41a99.49±9.63 78.36±8.90a65.42±7.32a50.31±6.78a99.13±10.30 76.69±7.23a63.68±6.32a52.37±4.99a

表2 外源性Galectin-9對SKOV3細胞中MMPs、E-cadherin及Vimentin表達量的影響(±s)

表2 外源性Galectin-9對SKOV3細胞中MMPs、E-cadherin及Vimentin表達量的影響(±s)

注：與陰性對照比較，aP＜0.01。

組別陰性對照4 μg/mL Galectin-9 8 μg/mL Galectin-9 16 μg/mL Galectin-9 Vimentin/GADPH 1.12±0.11 0.84±0.08a0.64±0.06a0.44±0.05aMMP2/GADPH 1.35±0.13 1.10±0.104a0.78±0.08a0.53±0.04aMMP9/GADPH 1.01±0.10 0.83±0.05a0.73±0.06a0.41±0.04aE-cadherin/GADPH 0.20±0.02 0.31±0.02a0.64±0.04a1.00±0.11a

3 討 論

侵襲轉(zhuǎn)移是卵巢癌患者死亡的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多因素、多步驟、復雜的過程，其包括細胞外基質(zhì)的降解，粘附的降低，穿過血管內(nèi)滲至微循環(huán)，后經(jīng)微循環(huán)系統(tǒng)穿過血管，外滲至組織，最終轉(zhuǎn)移至遠處形成新的轉(zhuǎn)移灶。因此細胞外基質(zhì)的降解是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的必要步驟，MMPs是降解細胞外基質(zhì)的最重要的蛋白水解酶，在細胞腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。MMP2不僅可以降解細胞外基質(zhì)中的明膠Ⅳ型膠原等，有利于腫瘤細胞沿著受損的基底膜向周圍浸潤，還可以通過新生毛細血管促進腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。MMP9是由多種細胞分泌的一種蛋白水解酶，是MMPs中分子量最大的酶，能夠降解細胞外基質(zhì)和基底膜，從而增加細胞的運動能力，促進腫瘤的擴散和轉(zhuǎn)移。申麗媛等[5]證實MMP2及MMP9在卵巢癌組織中的表達均高于正常卵巢組織及卵巢良性組織，并與卵巢癌的臨床分期有關，提示MMP2及MMP9對卵巢癌病情演變和預后評估具有重要意義。因此下調(diào)MMP2及MMP9的表達能一定程度上抑制卵巢癌的進展及侵襲行為。EMT是轉(zhuǎn)移發(fā)生的第一步，最早在胚胎發(fā)育過程中得到證實，EMT可誘導原發(fā)部位的腫瘤擴散，使得腫瘤侵犯周圍組織，并通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至遠處形成新的轉(zhuǎn)移灶，是卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要分子機制。EMT的分子標志性特征為細胞間黏附分子E-cadherin消失，一系列間充質(zhì)標記物的表達增加，包括波形蛋白(Vimentin)和纖連蛋白[6-7]。E-cadherin表達減少，有利于腫瘤細胞從原發(fā)部位脫落，促進腫瘤浸潤擴散。Vimentin高表達可以減弱E-cadherin介導的細胞間的黏附，從而促進細胞浸潤轉(zhuǎn)移。E-cadherin在卵巢癌組織中低表達，Vimentin在卵巢癌組織中高表達，并與卵巢癌組織臨床分期，組織學分級，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關，通過阻斷EMT的發(fā)生，能降低患病的風險[8]。因此逆轉(zhuǎn)EMT相關蛋白的表達，能抑制癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

Galectin-9是半乳糖結(jié)合蛋白家族的成員之一，屬于動物凝集素，能夠與細胞表面和細胞間質(zhì)中的半乳糖特異性的結(jié)合，發(fā)揮細胞間以及細胞與間質(zhì)間的信號傳遞作用。Galectin-9參與了機體許多生理和病理過程，包括細胞間黏附、細胞生長調(diào)節(jié)、炎癥反應和免疫調(diào)節(jié)等。Galectin-9廣泛分布于人體多數(shù)組織，包括腦、乳腺、胃、肝臟、胰島細胞、肺臟、子宮、扁桃體和多種免疫細胞。已報道Galectin-9在食管鱗狀細胞癌，乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、口腔鱗癌、膠質(zhì)瘤及肝癌中低表達，并與腫瘤的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移及預后密切相關[4]。Chan等[9]證實Galectin-9在口腔鱗癌中低表達，并在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的陽性表達低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Zhang等[10]證實肝細胞癌中Galectin-9的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，血管侵襲及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移密切相關，且陽性表達Galectin-9的肝細胞癌患者有更長的生存時間。以上的報道說明了Galectin-9的表達與腫瘤的結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關。本課題先前研究也證實Galectin-9與卵巢癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關。本研究在此基礎上探討了外源性Galectin-9對卵巢癌細胞SKOV3侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，結(jié)果表明，4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml Galectin-9能顯著的抑制卵巢癌細胞SKOV3的遷移侵襲能力，并下調(diào)MMP2、MMP9及Vimentin的表達，上調(diào) E-cadherin的表達。Nobumoto等[11]證實將Galectin-9靜脈注射到高轉(zhuǎn)移性B16F10膠質(zhì)瘤細胞及Colon26結(jié)腸癌細胞小鼠模型中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤小鼠中肺轉(zhuǎn)移受到抑制，粘附分子的表達上升，從而抑制腫瘤細胞粘附到血管內(nèi)皮及細胞外基質(zhì)。從而提示外源性Galectin-9能顯著抑制卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移，與調(diào)節(jié)MMPs及EMT相關蛋白表達有關。

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Effect of Galectin-9 on invasion and metastasis of ovarian cancer cells SKOV3.

PAN Li-ying1,HUANG Fu-hai2, ZHONG Xue-hua3.1.Department of Gynaecology and Obstetrics,Shajing People's Hospital of Baoan District of Shenzhen, Shenzhen 518125,Guangdong,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,People's Hospital of Guangming New District of Shenzhen,Shenzhen 518106,Guangdong,CHINA;3.Department of Clinical Medicine,Shajing People's Hospital of Baoan District of Shenzhen,Shenzhen 518125,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore effect of Galactose lectin-9(Galectin-9)on invasion and metastasis in ovarian cancer cells SKOV3.MethodsSKOV3 cells were treated with different concentrations of exogenous Galectin-9[0(negative control),4 μg/mL,8 μg/mL,16 μg/mL]for 48 h.The expression of Galectin-9 in SKOV3 cells was detected by Western blot.Cell viability was measured by MTT assay,and the ability of cell migration and invasion was detected by transwell assay.The expression of matrix metalloproteinase 2(MMP2),MMP9,EMT related proteins E-cadherin and Vimentin was detected by Western blot.ResultsCompared with negative control,4 μg/mL,8 μg/mL,16 μg/mL Galectin-9 upregulated the expression of Galectin-9 in SKOV3 cells(P＜0.01),and inhibited SKOV3 cells viability[(100.00±7.46)vs (77.92±8.03),(60.62±6.42),(47.63±5.41),P＜0.01],migration[(99.49±9.63)vs(78.36±8.90),(65.42±7.32),(50.31±6.78), P＜0.01]and invasion[(99.13±10.30)vs(76.69±7.23),(63.68±6.32),(52.37±4.99),P＜0.01],as well as down-regulated the expression of MMP2,MMP9 and Vimentin(P＜0.01)and upregulated the expression of E-cadherin(P＜0.01).ConclusionOverexpresion of Galectin-9 in SKOV3 cell could inhibit cell migration,invasion and metastasis,which is associated with down-regulation of the expression of MMPs and regulation of the expression of EMT related proteins.

Galactose lectin-9;Ovarian cancer cells SKOV3;Invasion;Metastasis

R737.31

A

1003—6350（2016）07—1039—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.07.003

2015-10-30)

廣東省深圳寶安區(qū)科技計劃社會公益項目(編號：2015230)

潘麗英。E-mail：panliying630@126.com