一種新型結(jié)核分枝桿菌檢測方法的研究

黃國清，蔡長爭，何樹泉，胡波，鄔艷波，蔡芬蘭，舒少為

(1.深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 518110；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510630)

一種新型結(jié)核分枝桿菌檢測方法的研究

黃國清1，蔡長爭1，何樹泉1，胡波2，鄔艷波1，蔡芬蘭1，舒少為1

(1.深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 518110；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510630)

目的 探討利用熒光量子點(QDs)開發(fā)新一代結(jié)核分枝桿菌的檢測方法。方法采用特異性多克隆抗體偶聯(lián)到磁珠上用于結(jié)核桿菌的分離和富集，然后用標(biāo)記QDs的鏈霉親和素檢測結(jié)合生物素標(biāo)記的肝素血凝素(HBHA)單克隆抗體的結(jié)核桿菌。采用牛結(jié)核分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌作為陽性樣品，以大腸桿菌和沙門氏菌作為陰性對照，以評估該方法的可行性。結(jié)果用抗酸染色能檢測到磁珠分離和富集的結(jié)核桿菌，直接觀察沒有發(fā)現(xiàn)陰性對照有熒光，但陽性對照可以觀察到熒光。直接觀察法的檢測限為104細(xì)菌/mL。當(dāng)采用熒光光度計檢測樣品時，其檢測限可以達(dá)到103細(xì)菌/mL。結(jié)論該方法能適用于包括結(jié)核分枝桿菌病原體的檢測，是一種具有前景的病原體的檢測方法。

熒光量子點；結(jié)核分枝桿菌；檢測

結(jié)核病是嚴(yán)重危及全球的公共衛(wèi)生問題之一，自1985年以來結(jié)核病疫情在全球范圍內(nèi)急劇上升，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，目前全球有近1/3的人，即20億人口感染了結(jié)核桿菌，其中活動性肺結(jié)核患者約2 000萬，每年新增結(jié)核患者800～1 000萬，每年約有300萬人死于結(jié)核病[1-3]。我國是全球22個結(jié)核病高發(fā)國家之一，活動性肺結(jié)核患者數(shù)居世界第二位[4]。近年來由于免疫缺陷性疾病，如人免疫缺陷性病毒(HIV)的感染、腫瘤患者和營養(yǎng)不良者的增多，以及多藥耐受的結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)，結(jié)核患者的人數(shù)呈上升趨勢。結(jié)核分枝桿菌的檢測對于結(jié)核患者的早期診斷、治療進程的監(jiān)控以及流行病學(xué)調(diào)查有著重要的意義。目前常規(guī)結(jié)核分枝桿菌的檢測，一般采用痰涂片檢測、金標(biāo)準(zhǔn)的固體和液體培養(yǎng)、結(jié)核菌素試驗和分子診斷等方法，但均因存在靈敏度和特異性較低，費時或價錢昂貴等缺陷，難以完全滿足臨床實際的需要，為及時而準(zhǔn)確地對結(jié)核患者進行診斷和治療，開發(fā)新型的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒已成為亟待解決的問題。隨著納米生物材料和納米技術(shù)的發(fā)展，功能化的磁珠可以用于對結(jié)核分枝桿菌的分離和富集，熒光量子點由于具有較有機熒光素優(yōu)越的許多獨特的光學(xué)特性，如其發(fā)射峰波長可由組成材料和粒徑大小來調(diào)節(jié),其激發(fā)光波長范圍很寬,具有較大的斯托克位移和狹窄對稱的熒光譜峰，從而具備了一元激發(fā)、多元發(fā)射的特點,且穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于有機染料，適合于體內(nèi)和體外對病原體和其他目標(biāo)分子的檢測。

在本研究中，我們用磁珠表面耦聯(lián)抗結(jié)核分枝桿菌屬特異性抗體用于結(jié)核分枝桿菌的分離和富集，然后用生物素化的抗-HBHA單抗，再用結(jié)合鏈霉親和素的的熒光量子點(QDs)進行檢測，用牛結(jié)核分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌作為陽性樣品和以大腸桿菌和沙門氏菌為陰性對照對該方法進行評價并研究其檢測限。

1 材料與方法

1.1 抗體 本研究中所用的抗體包括抗結(jié)核分枝桿菌肝素-結(jié)合血凝素(Heparin-binding hemagglutinin，HBHA)單克隆抗體(Santa Cruz公司)。生物素標(biāo)記的抗結(jié)核分枝桿菌PPD的兔多克隆抗體(南京金斯瑞生物科技有限公司)，生物素標(biāo)記的抗羊抗小鼠的多克隆抗體(南京金斯瑞生物科技有限公司)。

1.2 抗結(jié)核菌抗體與免疫磁珠(MBs)的結(jié)合 用上面提到的生物素標(biāo)記的多克隆抗體功能化結(jié)合鏈霉親和素包被的MBs。為了這個目的，40 mg抗體加到200 mL(10 mg/mL)的MBs，在室溫下孵育30 min。除去沒有結(jié)合的抗體，在磁場的作用下用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5次結(jié)合的MBs(Dynal MPC-s,Invitrogen，CA，USA)，溶解在含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖液中。

1.3 鏈霉親和素的QDs的功能化 CeSe QDs (15～20 nm)，其最大發(fā)射波長為655 nm，用ZnS為其外殼，和含一個羧基的多聚體(Q21321MP，Invitrogen，USA)。在按照說明書操作前，用鏈霉親和素包被。簡單地說，50 ml的QDs稀釋到400 mL的硼酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH 7.4)中，96 mL的鏈霉親和素溶液(10 mg/mL，Invitrogen，CA，USA)和11.4 mL的EDC (10 mg/mL，Sigma-Aldrich，MO，USA)，室溫下孵育90 min。鏈霉親和素包被的QDs用500 ml的硼酸緩沖液(50 mmol/L，pH 8.3)洗5次，然后溶解到50 mmol/L硼酸鹽(pH 8.3)緩沖液，至終體積為500 mL。

1.4 細(xì)菌菌株 為了評估，我們用牛結(jié)核桿菌(Pasteur)和結(jié)核分枝桿菌(n=3)作為陽性對照，這些菌株生長在Middlebrook 7H11(BD，USA)(含有OADC (油酸、白蛋白、葡萄糖和過氧化氫酶)、0.4%丙酮酸(Sigma-Aldrich，Germany)。陰性對照為大腸桿菌(E. coli，n=2)和沙門氏菌(Salmonella，n=4)，這些陰性對照細(xì)菌在腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基(Oxoid，UK)上培養(yǎng)24 h。

1.5 檢測限 為了評估每種方法的檢測限(Limit of detection，LOD)，我們用2份牛結(jié)核桿菌BCG溶液。系列稀釋后，用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌學(xué)技術(shù)確定其范圍為108～10細(xì)菌/mL。簡單描述如下，幾個長在固體培養(yǎng)基上的克隆懸浮在含PBS和6個玻璃珠的無菌旋蓋瓶中。為了使大塊的細(xì)菌團分散，懸液用漩渦器混合幾秒鐘，然后放置5 min。懸液中細(xì)菌的數(shù)量用濁度計比色確定。LOD定義為能與陰性對照差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的最低濃度。

1.6 細(xì)菌檢測 實驗的原理是基于用屬特異的多克隆和小鼠單克隆生物素化的抗體耦聯(lián)MBs分離細(xì)菌，最終用鏈霉親和素結(jié)合的QDs檢測熒光信號(圖1)。為了這個目的，1 mL每個稀釋度的細(xì)菌，組成為陽性和陰性對照或等體積的PBS-BSA(0.1%)空白，首先用結(jié)合MBs的屬特異多克隆抗體40 μL，然后加入1 μg(每個500 ng)HBHA單克隆抗體，然后1 μL(0.2 mg/mL)抗小鼠的生物素化的抗體(南京金斯瑞生物科技有限公司)，最后加入鏈霉親和素包被的QDs 4 μL。對于每個雜交步驟，稀釋液在37℃輕微震蕩20 min，在磁場作用下分離，用PBS-BSA(0.1%)。為了直接觀察熒光，樣品在UV燈(312 nm)下觀察，熒光強度也可以用熒光光度計(Infinite M200，Tecan USA)檢測。

圖1 細(xì)菌的檢測原理

2 結(jié) 果

2.1 抗結(jié)核桿菌抗體和MBs的結(jié)合 抗體和納米粒結(jié)合前后用分光光度計在280 nm檢測抗體是否和MBs的表面結(jié)合。進一步證實有抗體結(jié)合或無抗體結(jié)合后分離結(jié)核桿菌后采用抗酸染色是否MBs和抗體有結(jié)合(圖2)。與抗體結(jié)合的結(jié)核桿菌通過磁珠分離后染色陽性，但沒有結(jié)合抗體的結(jié)核桿菌通過磁珠分離沒有得到結(jié)核桿菌，因此，染色結(jié)果為陰性。

2.2 結(jié)核桿菌的檢測/檢測限 圖3表明空白和陰性對照沒有觀察到熒光信號，而結(jié)核分枝桿菌可以在檢測限之上觀察到陽性。在本研究中，LOD被定義為104細(xì)菌/mL，即實驗管能觀察到熒光。當(dāng)樣品用熒光檢測儀時本方法的檢測限能進一步減少到103細(xì)菌/mL (圖4)。為了證明該方法的有效性，對樣品(陰性和經(jīng)過系列稀釋的陽性對照)進行涂片后熒光顯微鏡檢測。與結(jié)核分枝桿菌陽性和陰性對照比較，磁珠周圍有熒光光暈。

圖2 結(jié)合多克隆抗體的磁珠結(jié)合富集結(jié)核分枝桿菌后的抗酸染色(×100)

圖3 直接熒光燈下觀察熒光

圖4 熒光光度計對細(xì)菌的檢測限

3 討 論

基于CdSe QDs可以檢測不同病原的DNA，該方法不易產(chǎn)生錯誤的結(jié)果，因為不需要DNA擴增[5-7]。QDs同樣可以用于檢測結(jié)核桿菌的表面抗原。這種方法在方法學(xué)上比較簡單，它不需要樣品處理，這點不同于需要DNA分離純化后檢測細(xì)菌DNA，因此，該方法適合床邊檢測。此外，使用QDs避免了在免疫檢測中使用熒光燃料的缺點，例如快速的光淬滅，較窄的激發(fā)廣譜和較低的信號強度。

筆者發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌通過抗體偶聯(lián)的MBs分離后，鏈霉親和素結(jié)合的CdSe QDs能夠特異地結(jié)合在結(jié)核桿菌病原體。該過程操作簡便，不需要任何昂貴的設(shè)備。采用一個簡單的光譜儀允許檢測1 000細(xì)菌/mL的樣品。下一步需要研究用其他蛋白或多個蛋白靶點或更明亮的QDs以提高其檢測限。本研究進一步完善后用于臨床標(biāo)本的研究，并與現(xiàn)有的結(jié)核桿菌的檢測方法進行對比。

本研究使用結(jié)核桿菌HBHA抗原，其分子量為28 kD，是一個甲基化表面相關(guān)蛋白，能夠介導(dǎo)結(jié)核桿菌和宿主之間的相互作用。HBHA作為一個非吞噬細(xì)胞的粘附因子在結(jié)核分枝桿菌肺外播散起重要作用[8-9]。HBHA是一個具有重要意義的免疫反應(yīng)蛋白和結(jié)合的臨床指示物[10-11]，因此筆者選擇HBHA作為檢測靶標(biāo)。在本研究中，筆者同時采用了結(jié)核桿菌的多克隆抗體和單克隆抗體，能夠增加檢測的特異性，同時也方便對其他表達(dá)HNHA的病原體的檢測。此外，在研究中使用QDs標(biāo)記的鏈酶親合素，能適合檢測結(jié)合生物素的樣品。

總之，按照本研究的思路，采用不同類型的納米探針，不需要昂貴的設(shè)備，只需要磁性設(shè)備和一個熒光燈，可以檢測不同病原體DNA和其表面抗原。

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A novel detection method for Mycobacterium tuberculosis.

HUANG Guo-qing1,CAI Chang-zheng1,HE Shu-quan1, HU Bo2,WU Yan-bo1,CAI Fen-lan1,SHU Shao-wei1.1.Department of Laboratory Medicine,Shenzhen Longhua New District Central Hospaital,Shenzhen 518110,Guangdong,CHIAN;2.Department of Laboratory Medicine,the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510630,Guangdong,CHINA

Objective To develop an assay incorporating cadmium selenide quantum dots(QDs)for the detection of mycobacterial surface antigens.MethodsThe bacterial cells were separated using magnetic beads coupled with genus-specific polyclonal antibodies and monoclonal antibodies for heparin-binding hemagglutinin.These complexes were then detected with anti-mouse biotinylated antibody and finally streptavidin-conjugated QDs which leads to the detection of a fluorescent signal.To evaluate the feasibility of the method,Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium tuberculosis(positive controls),as well as E.coli and Salmonella spp.that constituted the negative controls were applied.ResultsMycobacterium cells could directly be detected using acid-fast staining method after Mycobacterium cells were separated using immunomagnetic beads.The direct observation of negative samples did not reveal fluorescence as opposed to the mycobacteria mentioned above.The minimum detection limit of the assay was defined to 104bacteria/mL, which could be further decreased up to 103bacteria/mL when fluorescence was measured with a spectrofluorometer.ConclusionThe method described here can be easily applied for the pathogens including Mycobacterium tuberculosis, implying that this method has potential application for various different pathogens.

Quantum dots(QDs);Mycobacterium tuberculosis;Detection

R378.91+1

A

1003—6350（2016）07—1048—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.07.006

2015-11-22)

廣東省科技計劃項目(編號：2013B090500101)；廣東省深圳市龍華新區(qū)科技創(chuàng)新資金“社會公益科研項目”(編號：2013092)

胡波。E-mail：hxb1993@sina.com