組織S100Al mRNA和Snail mRNA檢測(cè)在卵巢疾病中的應(yīng)用

劉亞紅，孫蓓

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦二科，陜西 咸陽(yáng) 712000)

組織S100Al mRNA和Snail mRNA檢測(cè)在卵巢疾病中的應(yīng)用

劉亞紅，孫蓓

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦二科，陜西 咸陽(yáng) 712000)

目的 探討組織鈣結(jié)合蛋白S100Al mRNA和鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail mRNA檢測(cè)在卵巢疾病中的臨床應(yīng)用。方法選取2013年3月至2015年3月我院經(jīng)病理確診的卵巢病變組織標(biāo)本共68例，通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)卵巢良性囊腺瘤(良性腫瘤組)、交界性囊腺瘤(交界性腫瘤組)和卵巢囊腺癌(卵巢癌組)組織S100Al mRNA和Snail mRNA的表達(dá)，并測(cè)定各組血清癌胚抗原(CEA)、糖類抗原125(CA125)及人附睪分泌蛋白(HE4)水平，比較三組患者以上指標(biāo)的變化。結(jié)果卵巢癌組組織S100Al mRNA和Snail mRNA的表達(dá)量與交界性腫瘤組和良性腫瘤組比較明顯增高，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，交界性腫瘤組與良性腫瘤組比較明顯增高，差異也有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；卵巢癌和交界性腫瘤組S100Al mRNA和Snail mRNA相對(duì)表達(dá)量具有相關(guān)性(r=0.629、0.571，P＜0.01)，組織S100Al mRNA和Snail mRNA分別與血清CA125及HE4呈現(xiàn)相關(guān)性(r=0.632、0.587，P＜0.01；r=0.638、0.617，P＜0.01)。結(jié)論聯(lián)合檢測(cè)組織S100Al mRNA和Snail mRNA在卵巢良性囊腺瘤、交界性囊腺瘤和卵巢囊腺癌病變組織中的表達(dá)，可增加卵巢囊腺癌的早期檢出率，為上皮性卵巢疾病的鑒別診斷提供新的思路。

卵巢良性囊腺瘤；卵巢交界性囊腺瘤；卵巢囊腺癌；S100Al mRNA；Snail mRNA

卵巢上皮性腫瘤是最常見(jiàn)的卵巢腫瘤，占原發(fā)性卵巢腫瘤的50%～70%，占卵巢惡性腫瘤的85%～90%[1]。上皮卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤之一。卵巢癌早期癥狀不典型，在普通人群篩查中，無(wú)論是卵巢癌首選檢測(cè)標(biāo)志物癌胚抗原還是B超都不能夠有效診斷[2]。國(guó)內(nèi)外統(tǒng)計(jì)資料顯示，早期診斷的卵巢癌患者，手術(shù)及介入治療，90%的患者能存活5年以上，而已發(fā)生轉(zhuǎn)移的晚期卵巢癌患者5年生存率不足30%[3]。因此提高卵巢癌的早期診斷率，及對(duì)卵巢癌全面的術(shù)前評(píng)估對(duì)于卵巢癌治療處理及預(yù)后至關(guān)重要[3]。S100Al是鈣結(jié)合蛋白S100家族的成員，其與多種癌癥相關(guān)[2]。鋅指蛋白Snail是胚胎發(fā)育中促進(jìn)中胚層和神經(jīng)嵴形成的轉(zhuǎn)錄因子。SNAI1通過(guò)抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，導(dǎo)致癌細(xì)胞喪失上皮特性，富于侵襲和轉(zhuǎn)移特性[4]。本研究用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)68例卵巢良性囊腺瘤、交界性囊腺瘤和卵巢囊腺癌組織中Snail mRNA和S100Al mRNA的表達(dá)情況，探討兩個(gè)標(biāo)志物在卵巢癌中表達(dá)的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年3月至2015年3月我院經(jīng)病理確診的卵巢病變組織標(biāo)本共68例，患者年齡32～81歲，平均53.5歲。其中卵巢良性腫瘤組織(良性腫瘤組)20例，卵巢囊腺癌(卵巢癌組)30例，交界性囊腺瘤(交界性腫瘤組)18例。每例患者手術(shù)過(guò)程中均取適量卵巢組織。上皮性卵巢癌按照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO) 2000年分期：I～Ⅱ期12例，Ⅲ～Ⅳ期18例；按WHO分化標(biāo)準(zhǔn)：高分化(G1)9例、中、低分化(G2、G3)21例。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并得到所有研究對(duì)象的知情。

1.2 研究方法 采用RT-PCR方法研究卵巢良性囊腺瘤、交界性囊腺瘤和卵巢囊腺癌組織中鈣結(jié)合蛋白S100Al mRNA和鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail mRNA表達(dá)狀況，采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)測(cè)定各組血清癌胚抗原(CEA)、糖類抗原125(CA125)及人附睪分泌蛋白4(HE4)水平。

1.2.1 儀器、試劑和引物 RNA提取來(lái)自美國(guó)Invitrogen公司。lightCycler熒光PCR儀來(lái)自德國(guó)Roche公司。PCR試劑盒來(lái)自上海久盛醫(yī)療用品有限公司。

1.2.2 細(xì)胞分離和總RNA的提取 采用Trizol法提取組織中的總RNA，在分光光度計(jì)上檢測(cè)A260/280的比值以驗(yàn)證RNA的純度。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物，Snail正義鏈：5′-AATCGGAAGCCTAACTACAGCG-3′，反義鏈：5′-GTCCCAGATGAGCATTGGCA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小350 bp。S100Al的引物序列為：正義鏈5′-CAGGAATTCATGGCCTTTGT-3′，反義鏈5′-ATGATGCAGGCCGTTAAAAC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度365 bp。β-actin作為內(nèi)參照，β-actin的引物序列為：正義鏈5′-AGGCACTGGGGCTTCATCTGAC-3′，反義鏈5′-GCCTTCCATCCC TTTGCTTAG-3′；產(chǎn)物長(zhǎng)度650 bp。反應(yīng)條件：95℃，10 min→95℃，30 s→52℃，30 s→72℃，30 s，40個(gè)循環(huán)→72℃，10 min→4℃保存。

1.2.4 基因片段序列測(cè)定和分析 使用測(cè)序儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLAST應(yīng)用軟件與GenBank中的已知序列進(jìn)行同源性比較。

1.2.5 mRNA表達(dá)量測(cè)定 對(duì)擴(kuò)增目的片段進(jìn)行凝膠電泳，通過(guò)紫外光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描并記錄，用四維成像處理系統(tǒng)，測(cè)定各組的cDNA的特異性，RNA表達(dá)量與內(nèi)參照的比值代表mRNA表達(dá)量。S100Al mRNA和Snail mRNA電泳圖見(jiàn)圖1、圖2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson法，采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)評(píng)價(jià)組織S100Al mRNA和Snail mRNA的臨床意義，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 不同病變組織Snail mRNA表達(dá)

圖2 不同病變組織S100Al mRNA表達(dá)

2 結(jié) 果

2.1 血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果比較 卵巢癌組中的血清CEA、CA125及HE4水平分別與交界性腫瘤組和良性腫瘤組比較均增高,其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表1。

表1 各組血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果(±s)

表1 各組血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果(±s)

注：與良性腫瘤組比較，t=7.82、17.37、21.38，aP＜0.01；t=20.36、43.67、57.32，bP＜0.01；與交界性腫瘤組比較，t=17.53、37.22、47.93，cP＜0.01。

組別 例數(shù)CEA(ng/ml)CA125(U/ml)HE4(pmol/L)良性腫瘤組交界性腫瘤組卵巢癌組20 18 30 1.19±1.12 7.28±10.73a32.69±17.58bc12.33±5.71 69.07±170.37a339.7±77.38bc10.09±1.68 83.33±57.56a320.07±37.27bc

2.2 組織S100Al mRNA和Snail mRNA表達(dá)率和表達(dá)量比較 卵巢癌組兩標(biāo)志物交界性腫瘤組和良性腫瘤組比較明顯增高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，交界性腫瘤組與良性腫瘤組比較也增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表2。

表2 各組組織S100AlmRNA和SnailmRNA表達(dá)量比較(±s)

表2 各組組織S100AlmRNA和SnailmRNA表達(dá)量比較(±s)

注：與良性腫瘤組比較，t=12.39、10.67，aP＜0.01；t=33.62、32.57，bP＜0.01；與交界性腫瘤組比較，t=29.61、27.73，cP＜0.01。

組別 例數(shù)Snail mRNA S100Al mRNA良性腫瘤組交界性腫瘤組卵巢癌組20 18 30 0.26±0.06 0.43±0.08a1.13±0.14bc0.21±0.05 0.37±0.07a1.06±0.12bc

2.3 相關(guān)性分析 S100Al mRNA和Snail mRNA在卵巢癌和交界性腫瘤組織中的表達(dá)量具有相關(guān)性(r=0.629、0.571，P＜0.01)。在卵巢癌和交界性腫瘤組織S100Al mRNA和Snail mRNA表達(dá)量與血清CA125及HE4水平有明顯相關(guān)性(r=0.632、0.587，P＜0.01；r= 0.638，0.617，P＜0.01)。

2.4 利用ROC曲線來(lái)評(píng)價(jià)兩項(xiàng)標(biāo)志物的價(jià)值 卵巢癌組以交界性腫瘤組為參照，組織S100Al mRNA和Snail mRNA的AUC分別為0.803，0.768，P＜0.01，聯(lián)合檢測(cè)組織S100Al mRNA和Snail mRNA的AUC為0.953，P＜0.01，即組織S100Al mRNA和Snail mRNA在鑒別卵巢癌和卵巢交界性腫瘤疾病中有診斷意義。單獨(dú)檢測(cè)組織S100Al mRNA和Snail mRNA分別用于診斷交界性腫瘤時(shí)，以對(duì)照組為參照的AUC分別為0.537、0.607，P＜0.01，聯(lián)合檢測(cè)兩標(biāo)志物的AUC為0.783，P＜0.01。即組織S100Al mRNA和Snail mRNA在鑒別卵巢交界性腫瘤和良性腫瘤疾病中有診斷意義，見(jiàn)圖3～圖6。

圖3 檢測(cè)S100Al mRNA和Snail mRNA診斷卵巢癌和卵巢交界性腫瘤的ROC曲線

圖4 聯(lián)合檢測(cè)S100Al mRNA和Snail mRNA診斷卵巢癌和卵巢交界性腫瘤的ROC曲線

圖5 檢測(cè)S100Al mRNA和Snail mRNA診斷卵巢交界性腫瘤和良性腫瘤的ROC曲線

圖6 聯(lián)合檢測(cè)S100Al mRNA和Snail mRNA診斷卵巢交界性腫瘤和良性腫瘤的ROC曲線

3 討 論

研究證實(shí)，S100Al蛋白在心臟疾病中有著重要作用，其與多種神經(jīng)病變及多種癌癥均相關(guān)[2]。Sviatoha等[5]的研究證明，在多種惡性腫瘤中都存在S100Al表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象，所以，S100A1或許可以作為鑒別良惡性腫瘤組織的標(biāo)志物。有報(bào)道認(rèn)為，S100A1在正常卵巢組織中的表達(dá)較少，但在卵巢癌中的表達(dá)明顯增高[2]。本研究顯示S100A1在卵巢癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，其與交界組和對(duì)照組的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，推測(cè)S100A1的高表達(dá)與卵巢癌的發(fā)生相關(guān)，交界性腫瘤組的S100A1表達(dá)低于卵巢癌組(P＜0.01)，提示其在轉(zhuǎn)移和深部浸潤(rùn)等方面的機(jī)會(huì)較小。進(jìn)一步研究顯示交界組S100A1表達(dá)高于對(duì)照組(P＜0.01)，提示交界性腫瘤可能存在有低度惡性潛能。S100A1在卵巢癌和交界性腫瘤中的表達(dá)差異提示其可作為卵巢癌的早期診斷的分子標(biāo)志物，S100A1在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的分子機(jī)制尚不清楚[6]，這也是我們接下來(lái)所要探索的問(wèn)題，這對(duì)腫瘤的診斷和治療具有非常積極的意義。

近年來(lái)Snail在腫瘤發(fā)生的作用中越來(lái)越受到人們的關(guān)注。Parker等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在預(yù)后較差的早期乳腺癌患者的癌細(xì)胞中Snail呈現(xiàn)高水平表達(dá)，在侵襲性乳腺癌的上皮和內(nèi)皮細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)Snail的過(guò)表達(dá)，而在正常的乳腺中則沒(méi)有表達(dá)。Yokoyama等[8]研究發(fā)現(xiàn)，侵襲力強(qiáng)的口腔鱗癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有Snail的高表達(dá)，而侵襲力弱的口腔鱗癌細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到Snail的表達(dá)。有研究采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)83例卵巢囊腺瘤、不同分化程度的卵巢癌組織中Snail的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Snail在卵巢癌組織中的表達(dá)顯著高于卵巢囊腺瘤[9]。本研究通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同卵巢組織Snail的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Snail在卵巢癌組織中的表達(dá)顯著高于交界性腫瘤組和對(duì)照組(P＜0.01)，提示Snail可以作為卵巢癌早期診斷的標(biāo)志物。Snail表達(dá)在交界性腫瘤組和對(duì)照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示Snail檢測(cè)可能為卵巢腫瘤的手術(shù)治療提供依據(jù)。

S100Al mRNA和Snail mRNA在卵巢癌和卵巢交界性腫瘤組織中的表達(dá)量具有相關(guān)性(P＜0.01)，在上述兩組中S100Al mRNA和Snail mRNA表達(dá)量與血清CA125及HE4水平有明顯相關(guān)性，提示兩標(biāo)志物與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。在卵巢癌和交界性腫瘤這兩種疾病的鑒別診斷中有一定的意義。利用ROC曲線評(píng)價(jià)兩標(biāo)志物的結(jié)果顯示，組織S100Al和Snail檢測(cè)在鑒別卵巢癌和卵巢交界性腫瘤疾病中有診斷意義(P＜0.01)。單獨(dú)檢測(cè)組織兩標(biāo)志物對(duì)鑒別卵巢交界性腫瘤和卵巢良性腫瘤有診斷意義(P＜0.01)。

綜上所述，組織S100Al和Snail的檢測(cè)可應(yīng)用于上皮性卵巢腫瘤的鑒別診斷，并為卵巢癌的早期發(fā)現(xiàn)提供依據(jù)。

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Application of detecting S100Al mRNA and Snail mRNA in tissues in the patients with ovarian diseases.

LIU Ya-hong,SUN Bei.The Second Departerment of Gynaecology,the Second Affiliated Hospital of Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine,Xianyang 712000,Shaanxi,CHINA

Objective To explore the application of detecting S100Al mRNA and Snail mRNA in tissues in the patients with ovarian disease.MethodsA total of tissue specimens from ovarian disease diagnosed by pathological section were selected from March 2013 to March 2015.The expression of S100Al mRNA and Snail mRNA in tissues was detected in the ovarian benign cystic adenoma(benign tumor group),borderline cystic adenoma(borderline tumor group)and ovarian cystadenocarcinoma(ovarian cancer group)by RT-PCR technique,as well as the levels of serum carcino-embryonic antigen(CEA),carbohydrate antigen 125(CA125),and human epididymis secretory protein 4(HE4). The changes of the above indicators were compared among the three groups.ResultsThe expression rates of S100Al mRNA and Snail mRNA were significantly higher in ovarian cancer group than borderline tumor group and the benign tumor group(P＜0.01),and also in borderline tumor group than benign tumor group(P＜0.01).The relative expressions of S100Al mRNA and Snail mRNA in tissues were correlated in the ovarian cancer group and the borderline tumor group (r=0.629,0.571,P＜0.01),and the two markers were correlated with the levels of serum CA-125 and HE4(r=0.632, 0.587,P＜0.01;r=0.638,0.617,P＜0.01).ConclusionJoint detection of expression of S100Al mRNA and Snail mRNA in tissues in the ovarian benign cystic adenoma,borderline cystic adenoma and ovarian cystadenocarcinoma can increase the early detection rate of ovarian cystadenocarcinoma,providing a new thought for the differential diagnosis of the ovarian diseases.

Ovarian benign cystic adenoma;Borderline cystic adenoma;Ovarian cystadenocarcinoma;S100Al mRNA;Snail mRNA

R711.75

A

1003—6350（2016）07—1051—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.07.007

2015-09-18)

劉亞紅。E-mail：280310216@qq.com