耐藥肺結核分枝桿菌快速診斷和治療研究進展*

王燕平　葉品良　盧振方　陳　歡

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耐藥肺結核分枝桿菌快速診斷和治療研究進展*

王燕平1葉品良2盧振方1陳歡1

1.成都中醫藥大學基礎醫學院碩士研究生2013級(成都 610075)；2.成都中醫藥大學基礎醫學院方劑學教研室(成都 610075)

摘要：目的綜述近年對耐藥肺結核快速診斷及治療的研究進展。方法查閱國內外大量文獻，對耐藥結核病的診斷及其中西醫藥治療情況進行分析歸納。結果耐藥肺結核快速診斷主要依靠分子生物學檢測；耐藥結核病化療配合免疫、外科手術及中西醫藥結合治療。結論分子生物學檢測提高快速診斷耐藥肺結核效率，但由于設備、技術、費用等因素難以普及需進一步探索；快速有效治療方法仍在探索階段。

關鍵詞：耐藥結核分枝桿菌；快速診斷；治療；綜述

中國是全球結核病高發國，位居世界第二[1]，以肺結核最常見[3]。目前耐藥結核病發生率尤為突出。耐藥結核(DR-TB)指結核病患者所排痰液中結核分枝桿菌對一種或多種抗結核藥物產生耐藥性；耐多藥結核桿菌(MDR-TB)是指患者至少耐利福平、異煙肼兩者[3,4]，耐2 種或2種以上其他抗結核藥物者另列為：耐HS、RSE多少例或多少株等[5]。其快速診斷及防治是結核病疫情控制的關鍵。筆者就此查閱大量文獻作出如下綜述。

1　耐藥結核桿菌快速診斷方法

約1/5的肺結核病患者可無任何癥狀，午后低熱>1周,咳嗽、咯痰≥2周或咳血[6]等典型臨床癥狀,結核性胸膜炎，侵犯支氣管導致肺不張，代償性肺氣腫，肺實變[7]，支氣管擴張明顯形成毀損肺等體征則與耐藥結核病患者臨床表現無特異性差異。結核分枝桿菌痰培養用于確診、耐藥監測和藥物敏感性試驗，是診斷“金標準”，但其耗時長，不能作為快速診斷手段。

1.1快速培養儀檢測系統BACTEC MGIT960快速培養系統和Bact/ALERT 3D系統均基于液體培養基，通過利用培養管中對培養基中O2和CO2濃度敏感的特殊探測器來判斷是否有細菌生長。張娟等[8]通過實驗對比BACTECTM MGTM960與羅氏痰培養顯示自動檢測系統檢出敏感性與特異性優于后者，檢出時間為4-16d。BacT ALERT3D培養系統，是通過定時探測特殊感應器探測板顏色變化，經自動化測算后將所得陽性菌液接種于含相應濃度抗結核藥物的培養瓶，用比例法判定藥敏性，該系統保證了結核菌檢測標準化和質控，較傳統培養基提高陽性率約10%～15%，1～2周內可報告結果，減少工作量及保證安全，但依賴特殊培養儀器，價格昂貴，限制其功能使用及普及[9]。1.2顯微鏡觀察藥物敏感性檢測(microscopic observation drug susceptib ility,MODS )技術由Cavieds建立，將標本接種在24孔細胞培養板液體培養基中,加入相應抗結核藥后置于特定條件下培養。MTB在培養基中生長會分泌索狀因子，使其呈索狀特征性結構。通過每天鏡下對特征性索狀結構生長的觀測[10]，來確定有無MTB生長及其對藥物的敏感狀態。若有索狀結構取之進行抗酸染色鑒定，呈抗酸桿菌即為陽性；接種40d后仍未觀察到特征性結構則判定為陰性。MODS培養陽性反應結核菌在有抗結核藥存在的情況下還能生長，則視為已產生耐藥性。有研究表明此法的敏感性和特異性較高[11]，其檢測結果與傳統羅氏培養和鑒定法結果符合率為97%[12]，不依賴特殊儀器，成本低，操作安全。但檢測者因長時間觀察會導致視覺疲勞[13]。

1.3 基于DNA擴增(PCR)的檢測方法

1.3.1巢式PCR(也稱套式PCR)用內、外兩套引物作兩輪PCR，第二輪PCR是以第一輪PCR的產物作模板，再將擴增產物進行測序以檢測其基因情況。有研究結果表明巢式PCR能準確、特異地檢測耐RFP的結核分枝桿菌菌株[14]。1.3.2PCR一單鏈構象多態性分析(PCR—SSCP)其原理是PCR擴增產物經變性后產生兩條互補單鏈，各單鏈的堿基序列不同形成不同的空間構象。其單鏈的空間構象因某一片段(甚至是單個堿基的變化)的堿基序列發生突變或存在多態性而變化，導致其泳動速度改變。凝膠上由不同構象DNA片段遷移率不同而顯現不同帶型，再與對比帶型比較，即可判定待測樣品是否存在突變。該法檢測單堿基突變簡便可靠。有研究顯示該法對耐2 種以上藥物的結核桿菌檢出率較高[15]。本法簡便快速，特異性、敏感性高，價廉，但技術要求高。

1.4基于DNA測序技術的檢測方法

1.4.1DNA直接測序PCR—DNA序列測定簡便、快速，但影響因素較多，只能用于確定有無基因突變而不能確定突變部位和性質，目前DNA測序已作為MTB耐藥性測定的金標準。因費用昂貴，使其應用受限。故該法多作為評價其他方法的參考方法或與其他方法結合應用。1.4.2焦磷酸測序法該技術是由Nyren等于1987年發展起來的一種新型依靠生物發光進行的實時DNA測序技術。鄭瑞娟等[16]運用該法檢測四種耐藥結核菌耐藥性，結果顯示該法能快速、準確、高通量檢測結核分枝桿菌對異煙肼、利福平、阿米卡星、氧氟沙星耐藥性，是一種可對結核菌多種耐藥性進行快速檢測，并獲得精確基因序列資料，操作簡單的方法。但目前該技術適用于已知的25～30個核苷酸的短序列測序分析，對長序列測序分析有待進一步探索。

1.5基于分子雜交技術的檢測方法

1.5.1限制性片段長度多態性分析(restrictionfrag-IEtantlength polymorphism，RFLP)是限制性內切酶、核酸電泳、印跡(blot)技術、探針雜交技術的綜合應用。標準的結核菌RFLP分析方法學已在國際得到廣泛認同并采用，使全球范圍內結核分枝桿菌菌株水平鑒定的比較成為可能。

1.5.2DNA芯片檢測DNA芯片檢測是目前分子生物學最前沿的方法。將多種探針與待測樣本的DNA或RNA進行雜交。通過檢測雜交信號強度以獲取樣品分子的數量和序列信息。該法同時將大量探針固定于基片上，可一次檢測和分析大量樣品。本法快速、準確，但芯片制備復雜，檢測成本高。1.5.3線性探針技術(Hain Geno-Type@MTBDRplus，簡稱HAIN)將標本提取結核分枝桿菌DNA擴增后直接與探針雜交，根據探針組顯色情況判定是否耐藥。黃玉平等[17]應用HAIN對459例涂陽肺結核患者痰標本進行快速檢測耐多藥肺結核研究。顯示HAIN與傳統藥敏試驗比較，二者耐藥特異性、靈敏度吻合率高。耗時≤24h。但需特殊設備和環境，操作技術和防污染措施要求嚴格，普及應用有一定難度。1.6血清蛋白指紋圖譜測定近年國內外相關學者應用蛋白質指紋圖譜技術(PFT)、表面增強激光解析電離飛行時間質(SELDI-TOF-MS)技術和蛋白芯片技術進行肺結核診斷研究并初步建立了診斷模型，為蛋白質組學用于結核病的診斷提供了科學依據。方素芳等[18]應用該技術檢測臨床痰培養陽性包含耐藥肺結核患者的血清蛋白，結果表明該方法簡便、快速，標本用量少，可能成為篩選耐多藥肺結核的一種新檢查指標。

2　耐藥結核桿菌治療現狀

2.1西醫治療

2.1.1化療法耐藥結核病化療分為注射期、非注射期兩個治療階段，一般耗時9～18個月，耗時長需嚴格遵守早期、聯合、適量、規律、全程和督導原則。選藥遵守至少應包括吡嗪酰胺、一種氟喹諾酮類藥物(推薦高代喹諾酮)、一種注射劑(首選卡那霉素或丁胺卡那霉素)、乙硫異煙胺(或丙硫異煙胺)和環絲氨酸(如果不能應用環絲氨酸則使用對氨基水楊酸替代)原則，其中吡嗪酰胺的應用存在廣泛爭議，因該藥耐藥率已高達51%[19～22]。

除常規化療藥物外，SQ109、Quinolones、TMC-207、PA-824、OPC-67683等化療新藥近年處于臨床和臨床前研究。SQ109是乙胺丁醇衍生物的第2代抗菌藥，能明顯改善耐藥結核菌活性，動物實驗有與異煙肼相當的抗菌活性，耐藥突變發生率低。喹諾酮類通過抑制結核菌旋轉酶阻礙DNA復制，使DNA降解或死亡。TMC-207是二芳基喹啉類似物，對耐多藥結核菌有相同抗菌活力，與其他抗感染藥物無交叉耐藥。PA-824屬硝基咪唑吡喃類，用于抗結核最具代表性與異煙肼活性相當的新藥，其抗菌活性僅表現在結核菌復合群，尤其針對非繁殖期結核菌或持留菌和耐藥菌株，與傳統抗結核藥物無交叉耐藥性[23]。OPC-67683是一種抑制分枝菌算合成的抑制劑，具有很強的抗結核菌包括耐藥結核菌活性[24]。2.1.2介入治療以纖支鏡局部注藥為主，借助纖支鏡，將抗結核藥物直接注射于受損肺組織局部以提高受侵襲部位抗菌藥物濃度而殺菌，適用于低濃度抗結核藥耐藥。在此基礎上發展了經胸部X線或CT定位后[25]經皮肺穿刺注藥療法及經支氣管動脈介入給藥等法。

2.1.3化療結合外科手術當結核病患者出現經4～5種敏感抗結核藥治療半年至1年后仍排菌、反復感染、咯血、合并空洞內曲霉球等；或除對2～3種很弱的抗結核藥外的所有抗結核藥敏感性逐漸下降至耐藥；或活動病灶僅局限在肺葉或一側全肺的上述無嚴重呼吸系統慢性基礎疾患或其他并發癥等[26]可承受手術者，已越來越建議使用化療結合手術進行治療。

2.1.4免疫治療患者免疫系統遭受結核菌及化療藥物破壞，免疫治療常與化療結合使用，我國目前常用免疫制劑為細胞因子類、分枝桿菌制劑與胸腺肽等，療效均較為理想。近年，國內外正圍繞免疫治療及治療指征、時機、療程、藥物選擇、療效評估等多方面深入分析，研發新型、有效的免疫制劑[27]。2.2中醫及中西醫治療現狀中醫對肺癆主要以“殺蟲”“扶正”為根本治則。殺蟲常選中藥為百部、海浮石、大蒜[28]、黃連；夏枯草、狼毒，貓爪草、苦參，據報道能增強感染肺結核小鼠的免疫力[29]，水車前、貓爪草、苦參有研究表明具有抑菌作用[30]；扶正注重臟腑辨證及陰陽盛衰，常分8型[31]：肺氣虛、肺陰虛、肺陽虛、肺脾兩虛、肺腎陰虛、肝火刑肺、心肺兩虛、陰虧陽損。中醫治療特色是辨證論治，但不同醫家遣藥處方不同，主要包括：古方化裁、自擬方、中成藥。研究報道[32，33]運用保真湯加減、八珍散、血府逐瘀湯、加味苓桂術甘湯、月華丸、百合固金湯、結核靈片、抗癆保肺丸、保肺丸、地榆稚草湯、肺癆膏、百部丸[34]、海浮石丸[35]、肺癆康[36]、結核散I+II號、復方蜈蚣散、蟲草丸、金盾膠囊等，與抗結核西藥聯合使用療效值得期待[37]。

3　結語

耐藥結核病疫情給抗癆工作帶來新挑戰，其耐藥機制、診斷、防治等目前尚未取得重大突破。耐藥型致病并無特異性臨床表現，但給患者、醫療事業、傳染病防治等帶來極大威脅，故對其能快速診斷，及時有效防治尤為重要。目前傳統痰培養仍是診斷“金標準”，但耗時長。分子生物科學技術的崛起為快速診斷耐藥結核病提供研究方向，其中巢式PCR、PCR—SSCP是分子生物檢測手段初期方法，具有操作技術要求高、易污染等缺點，已少用。其余快速診斷技術存在設備昂貴、操作嚴格或影響因素多等缺點，但檢測效率均較傳統培養法提高。因此，在檢測設備及技術等方面有待深入研究，使其能向基層醫療機構普及。目前西醫治療以主流抗結核藥及聯合其它療法為主。但化療藥物對患者肝[38]、腎[39]、內分泌系統、免疫系統、神經系統等多系統器官均有不同程度損傷，介入及手術治療等運用范圍局限。中醫臨床不乏中醫藥及中西醫結合治療耐藥結核病療效明顯的報道[40]，但對該病的認識及治療紛繁復雜，未形成高效規范化治療，仍處于各家學說，百家爭鳴狀態。因此，需中西醫及其他學科領域專家學者共同努力，進一步研究耐藥結核菌的有效診治方法。

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*基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.81173382)，四川省教育廳(No.12ZAO32)

doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.05.073

文章編號：1003-8914(2016)-05-0756-03

收稿日期：(本文校對：劉言言2015-04-17)