當(dāng)歸揮發(fā)油分子蒸餾餾分GC-MS分析及抗氧化研究

張慶，茹慶國，林紅梅，李輝，劉艷，吳清北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102

?

當(dāng)歸揮發(fā)油分子蒸餾餾分GC-MS分析及抗氧化研究

張慶，茹慶國，林紅梅，李輝，劉艷，吳清
北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102

摘要：目的研究當(dāng)歸揮發(fā)油分子蒸餾后各餾分的化學(xué)組成及抗氧化能力。方法用分子蒸餾設(shè)備對(duì)當(dāng)歸揮發(fā)油進(jìn)行分餾，采用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）表征各餾分的化學(xué)組成，采用主成分分析法（PCA）分析其化學(xué)組成的差異，用2,2-二苯基-1-苦基苯肼（DPPH）自由基清除能力評(píng)價(jià)各餾分的抗氧化能力。結(jié)果當(dāng)歸揮發(fā)油經(jīng)分子蒸餾后得到6個(gè)餾分。GC-MS結(jié)果顯示藁本內(nèi)酯是各餾分的主要成分。PCA結(jié)果顯示各餾分除了在Z-藁本內(nèi)酯上的差異外，餾分6中的油酸和餾分5中的Z-氧代環(huán)十七碳-8-烯-2-酮與其他餾分有較大差異。抗氧化能力測(cè)定結(jié)果顯示各餾分都有抗氧化能力但有差異，而且對(duì)餾分中藁本內(nèi)酯的含量無依賴性，餾分6和餾分5的抗氧化能力較強(qiáng)，可能與其所含的特異性成分有關(guān)。結(jié)論本研究可為當(dāng)歸和其他中藥揮發(fā)油的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸；揮發(fā)油；分子蒸餾；氣相色譜-質(zhì)譜法；抗氧化

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels.的干燥根，有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便功效[1]，廣泛應(yīng)用于臨床。現(xiàn)代藥理研究表明，當(dāng)歸的有效成分有顯著抗血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)保護(hù)、提高機(jī)體免疫力和抗腫瘤等作用。揮發(fā)油是當(dāng)歸的主要有效成分之一，有提高免疫力、消炎鎮(zhèn)痛和抗血小板聚集等作用[2-3]。

超臨界流體萃取法是一種快速、清潔的提取技術(shù)，提取過程中所需溫度低，能保持揮發(fā)油成分的穩(wěn)定，是中藥揮發(fā)油常用的提取手段之一。分子蒸餾也稱為短程蒸餾，是一種快速、高效、無污染的分離和濃縮技術(shù)，該技術(shù)被認(rèn)為是分離和純化天然產(chǎn)物的常用方法，尤適用于高沸點(diǎn)、高黏度且熱敏性物質(zhì)分離，被廣泛用于中草藥揮發(fā)油和其他精油的分離[4-5]。

中藥揮發(fā)油成分復(fù)雜，來源廣泛，有豐富的藥理活性，如在心腦血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)、抗炎、抗腫瘤等方面均有良好作用，在醫(yī)藥方面應(yīng)用前景廣闊[6]。脂質(zhì)過氧化與許多疾病有關(guān)，如癌癥、心血管疾病等。2,2-二苯基-1-苦基苯肼（DPPH）自由基清除能力在體外抗氧化實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用于體外評(píng)價(jià)揮發(fā)油抗氧化活性[7-9]。

本研究采用超臨界流體萃法取制備當(dāng)歸揮發(fā)油，使用分子蒸餾設(shè)備對(duì)所得揮發(fā)油進(jìn)一步分餾，應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）對(duì)所得餾分的化學(xué)組成進(jìn)行分析，并用主成分分析法（PCA）分析各餾分化學(xué)組成的差異性，采用DPPH自由基清除能力評(píng)價(jià)各餾分的抗氧化能力，為當(dāng)歸及其他中藥揮發(fā)油的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1　儀器與試藥

HA220-50-01超臨界流體萃取儀（江蘇南通華安超臨界萃取有限公司），BSA224S分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），VLK-70分子蒸餾設(shè)備（德國瑞達(dá)有限公司），Thermo Finnigan 2000 Trace DSQ氣相色譜-質(zhì)譜儀（美國Thermo公司），Mutiskan GO多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）。

當(dāng)歸飲片，購自北京本草方源藥業(yè)有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定系劉春生教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels.的干燥根。將當(dāng)歸飲片粉碎成粗粉用于進(jìn)一步的提取。DPPH、二甲基亞砜（DMSO），Sigma-Aldrich公司；色譜級(jí)乙酸乙酯，F(xiàn)isher公司；無水乙醇、無水硫酸鈉，北京化工廠。

2　方法

2.1超臨界流體萃取及分子蒸餾

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期確定的最佳提取工藝對(duì)當(dāng)歸進(jìn)行超臨界流體萃取[9]，以CO2為萃取溶劑。提取工作條件如下：工作壓力30 MPa，工作溫度50 ℃，提取時(shí)間2 h，CO2流量25 L/h；分離器Ⅰ的工作壓力為8 MPa，溫度50 ℃；分離器Ⅱ的壓力為提取系統(tǒng)尾部的壓力，工作溫度35 ℃。

用分子蒸餾設(shè)備對(duì)所得揮發(fā)油進(jìn)行分餾，工作條件如下：刮刀轉(zhuǎn)速300 r/min，分子蒸餾過程真空度為0.35 mbar，滴速為1～2滴/s。通過改變溫度來獲得不同的餾分。將所得餾分保存在-20 ℃冰箱中用于進(jìn)一步研究。

2.2總提取物與各餾分分析

將各餾分適當(dāng)稀釋后，用無水硫酸鈉脫水，然后采用GC-MS進(jìn)行分析。采用安捷倫DB-5 MS柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm），進(jìn)樣口溫度230 ℃；升溫程序：80 ℃以3 ℃/min升溫至167 ℃，保持2.5 min，以2 ℃/min升至202 ℃，以4 ℃/min升至280 ℃，保持15 min；載氣為高純氦氣，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，溶劑延遲4 min。離子源溫度230 ℃，電離源為EI，電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃，掃描質(zhì)量范圍為35～550 amu。

2.3抗氧化能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[10-12]方法，并稍作修改，測(cè)定DPPH自由基清除能力。精密稱取DPPH粉末0.007 98 g放于1000 mL容量瓶中，加無水乙醇定容，充分搖勻，得到濃度為200 μmol/L的DPPH儲(chǔ)備液。將各餾分用DMSO溶解，分別稀釋成相同的系列濃度梯度：100、80、60、40、20、10、5、1、0.5、0.1 mg/mL。分別取各濃度梯度的樣品10 μL，加入到已盛放有90 μL 0.2 mmol/L DPPH溶液的96孔板中，對(duì)照組加入等量的DMSO，空白組用等量無水乙醇代替DPPH溶液。25 ℃避光反應(yīng)20 min后，于518 nm處測(cè)定反應(yīng)混合物的吸光度，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，計(jì)算DPPH清除率。DPPH清除率（%）＝[1－(As－Aa)÷Ac]× 100%。其中，As、Aa、Ac分別代表樣品組、空白組（用DMSO代替樣品溶液）和對(duì)照組（用乙醇代替DPPH溶液）的吸收度。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

抗氧化試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Unscrambler 9.7進(jìn)行主成分分析。

3　結(jié)果

3.1當(dāng)歸揮發(fā)油及分子蒸餾各餾分

本研究用超臨界流體萃取法制得了棕色澄明的當(dāng)歸揮發(fā)油，得率為1.4%，其中當(dāng)歸揮發(fā)油中藁本內(nèi)酯的相對(duì)含量為65.98%。

當(dāng)歸揮發(fā)油進(jìn)行分子蒸餾后得到6個(gè)不同的餾分，在100 ℃下分離得到了餾分1（F1），然后將殘?jiān)M(jìn)一步分離，在110 ℃時(shí)，得到餾分2（F2），并將所得的殘?jiān)凑丈鲜龇椒ㄟM(jìn)一步分離，在120、130、140、150 ℃分別獲得了餾分3（F3）、餾分4（F4）、餾分5（F5）、餾分6（F6）。從F1到F6的顏色逐漸加深，從淺黃色變化到橙黃色。

3.2所得餾分的氣相色譜-質(zhì)譜分析

通過與NIST 2.0質(zhì)譜圖庫提供的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比較，并查閱相關(guān)參考文獻(xiàn)，確定各餾分中的化學(xué)成分。

GC-MS分析的6個(gè)餾分化學(xué)成分及相對(duì)含量見表1，采用面積歸一化法確定餾分中各化學(xué)成分的相對(duì)含量。

表1　當(dāng)歸揮發(fā)油各餾分的化學(xué)組成

續(xù)表1　

藁本內(nèi)酯是當(dāng)歸揮發(fā)油中的主要有效成分，GC-MS結(jié)果顯示，藁本內(nèi)酯仍是各餾分中含量最高的成分。各餾分中藁本內(nèi)酯含量從低到高依次為：F6 （32.77%）＜F5（48.63%）＜F1（62.46%）＜F2 （72.27%）＜F4（75.28%）＜F3（79.97%）。

3.3主成分分析

為進(jìn)一步研究各餾分中化學(xué)成分的差異性，采用Unscrambler軟件中的PCA功能，對(duì)6個(gè)餾分中的化學(xué)成分進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1、圖2。

以6個(gè)餾分中所含化學(xué)成分的含量為變量進(jìn)行分析，提取了2個(gè)主成分，圖1、圖2分別為得分圖和載荷圖，分別表示經(jīng)過降維后6個(gè)餾分所含化學(xué)成分在二維空間的分布情況。從圖1可以看出，主成分1解釋了總變異的89%，主成分2解釋了總變異的8%。F1、F2、F3、F4處于第一一主成分軸的右邊，在主主因子1上得分較高高，且F2與與F4化學(xué)成分相似性最高；F6處于第二主成分軸的上邊，在主成分2上得分較高。由圖2可知，Z-藁本內(nèi)酯在主因子1上載荷最大，說明6個(gè)餾分Z-藁本內(nèi)酯的含量差異最大；F6與其他餾餾分差異性較大，第二主成分主要與油酸有關(guān)，說明油酸可以作為F6的特征性成分。另外，（Z）-氧代環(huán)十七碳-8-烯-2-酮對(duì)F5的差異性影響較大，可作為F5的特征性成分。而其他化學(xué)成分重疊的較多，說明它們們的相似性較較高。餾分中有特征性成成分的存在，可能會(huì)會(huì)影響其抗氧氧化能力。

圖1　6個(gè)餾分化學(xué)成分主成分分析得分圖

圖2　6個(gè)餾分化學(xué)成分主成分分析載荷圖

3.4各餾分DPPH自由基清除能力

所有餾分均有DPPH自由基清除能力，且具有劑量依賴性，隨著劑量增大而提高，各餾分的DPPH自由基清除率曲線見圖3。用半數(shù)有效量（EC50，反應(yīng)20min后清除50%DPPH自由基所需的樣品濃度）評(píng)價(jià)各餾分自由基清除能力的強(qiáng)弱，見表2。DPPH自由基清除能力強(qiáng)弱依次為：F6＞F5＞F4＞F1＞F33＞F2。結(jié)合各餾分中藁本內(nèi)酯含量可知，藁本內(nèi)酯不不是決定各餾分抗氧化能力的唯一因素。

圖3　各餾分DPPH 自由基清除率曲線

表2　各餾分中藁本內(nèi)酯相對(duì)含量及其DPPH自由基清除率的EC50

4　討論

本研究GC-MMS結(jié)果顯示示各成分具有有一定的相似似性，主要成分藁本本內(nèi)酯含量有有明顯差異，隨著蒸餾的的進(jìn)行，各餾分中藁藁本內(nèi)酯含量量呈現(xiàn)先增后后減的趨勢(shì)。

本研究采用DDPPH自由基基清除能力評(píng)評(píng)價(jià)各餾分的的抗氧化能力。結(jié)果果顯示，各餾餾分均有抗氧氧化能力，其其抗氧化能力有劑量量依賴性。結(jié)結(jié)合各餾分中中藁本內(nèi)酯的的含量分析，F(xiàn)6藁本內(nèi)酯含量最低而抗氧化能力最強(qiáng)，相反，F(xiàn)2藁本內(nèi)酯含量相對(duì)較高，其抗氧化能力卻相對(duì)較弱，這表明各餾分中藁本內(nèi)酯的共存成分對(duì)餾分的抗氧氧化能力發(fā)揮揮了重要的作作用。結(jié)合PPCA分析結(jié)果，F(xiàn)F6中的油酸、F5中的（ZZ）-氧代環(huán)十十七碳-8-烯-2-酮是是各自的特有有成分，且F6和F5的抗抗氧化能力都都較強(qiáng)，，說明各餾分分中與藁本內(nèi)內(nèi)酯共存的化化學(xué)成分可能能起到了了協(xié)同抗氧化化作用。因此此，本研究可可為當(dāng)歸及其其他中草草藥揮發(fā)油的進(jìn)一步研究開發(fā)和利用提供有價(jià)價(jià)值的資資料。

[1] 國家家藥典委員會(huì).中中華人民共和國藥藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科科技出版版社,2010：124--125.

[2] 劉醫(yī)輝,楊世英,馬偉林,等.當(dāng)歸藥藥理作用的研究進(jìn)展[J].中國當(dāng)代代醫(yī)藥,,2014,21(22)：1192-193,196.

[3] 李曦,張麗宏,王曉曉,等.當(dāng)歸化學(xué)學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中中藥材,,2013,36(6)：10023-1028.

[4] 李燕燕,劉軍海.分子蒸餾技術(shù)在天然然產(chǎn)物分離純化中應(yīng)用進(jìn)展[J].糧糧食與油油脂,2011(3)：77-11.

[5] 徐浩浩鋒,楊華俊,俞嵐嵐.中藥有效成分分現(xiàn)代提取技術(shù)研究進(jìn)展[J].海峽峽藥學(xué),,2012,24(1)：133-18.

[6] 黃羅羅生,顧燕飛,李紅紅.中藥揮發(fā)油及及芳香性藥物的研究進(jìn)展[J].中國國中藥雜雜志,2009,34(122)：1605-1611.

[7] AROORA N, PANDEY-RRAI S. GC-MS anaalysis of the essential oil of Celasstrus paniculaatus Willd. seeeds and antioxidant, anti--inflaammatory study oof its various soolvent extracts[J]. Industriall Cropss and Products,2014,61：345-351.

[8] 趙晨晨,李蓉,鄒國林..桂丁、花椒揮發(fā)發(fā)油抗氧化活性及及其方法研究[J].武漢大大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版版),2008,54(4)：447-450.

[9] 趙晨.植物揮發(fā)油抗氧化活性的研究[J].中國調(diào)味品,2008,33(11)：40-43.

[10] 姜玉蘭,樸惠善,李鎬.桑葉抗氧化活性成分的研究[J].中藥材, 2008,31(4)：519-522.

[11] 陳智坤,梁呈元,李維林,等.薄荷不同溶劑提取物抗氧化活性的研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(3)：100-103.

[12] 付曉丹,湯春豐,劉壤蓮,等.枇杷葉黃酮提取物的抗氧化作用研究[J].食品工業(yè)科技,2015,30(1)：135-139.

（修回日期：2015-06-24；編輯：陳靜）

GC-MS Analysis and Antioxidant Activity Study of Distillates Separated from Essential Oil

of Angelicae Sinensis Radix by Molecular Distillation ZHANG Qing, RU Qing-guo, LIN Hong-mei, LI Hui, LIU Yan, WU Qing (Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

Abstract:Objective To study composition and antioxidant capacity of distillates separated from the essential oil of Angelicae Sinensis Radix by molecular distillation. Methods The distillates of the essential oil of Angelicae Sinensis Radix were obtained by molecular distillation equipment, and the composition of distillates was analyzed by GC-MS. The principal component analysis (PCA) was used to analyze the difference of the composition of each fraction. The DPPH free radical scavenging ability was applied to evaluate the antioxidant capacity of distillates. Results Six fractions were obtained by molecular distillation from the essential oil of Angelicae Sinensis Radix. GC-MS results showed that ligustilide was the main component in each fraction; PCA results showed that oleic acid in fraction 6 and Z-Oxacycloheptadec-8-en-2-one in infraction 5 were different from the other fractions; The antioxidant capacity results showed each fraction had antioxidant capacity, but they were different, and the capacity of antioxidant were uncorrelated with the content of ligustilide in distillates; antioxidant ability of fraction 6 and fraction 5 was strong, which may be related to specific components. Conclusion This study provided reference for further development of the volatile oil in Angelicae Sinensis Radix and other herbal medicine.

Key words:Angelicae Sinensis Radix; essential oil; molecular distillation; GC-MS; antioxidant

收稿日期：（2015-06-11）

通訊作者：吳清，E-mail：qwu@vip.sina.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81073059)

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-5304(2016)02-0082-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.023