MSCs聯合PRP對兔前交叉韌帶重建后腱骨愈合的影響

楊軍軍，徐 斌，徐洪港，涂 俊，李 洋

MSCs聯合PRP對兔前交叉韌帶重建后腱骨愈合的影響

楊軍軍，徐 斌，徐洪港，涂 俊，李 洋

目的探討骨隧道內局部應用自體間充質干細胞（MSCs）聯合富血小板血漿（PRP）對兔前交叉韌帶重建后腱-骨愈合的影響。方法24只健康的新西蘭大白兔隨機平均分配為M組、P組、MP組及C組。分別在肌腱骨道內注入以生物蛋白膠為媒介的MSCs、PRP、MSCs復合PRP，C組僅注入生物蛋白膠。于術后4、8、12周3個時間點取各組兔膝關節標本切片染色，行組織學觀察及分析。結果對于腱骨早期愈合有標志性意義的Sharpy樣纖維在術后第4周MP組即可觀察到，并隨著愈合時間的延長，M組、P組及C組也相繼出現Sharpy樣纖維且Sharpy樣纖維的量是持續增加的。各組標本在3個時間點組織形態學Buark評分差異有統計學意義（P＜0.05）。結論聯合使用MSCs和PRP可促進骨道肌腱早期愈合，比二者單獨使用的作用強。

間充質干細胞；富血小板血漿；前交叉韌帶；腱骨愈合

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）在維持膝關節的穩定中起著重要作用。ACL損傷是一種常見的運動損傷，目前臨床上治療ACL損傷的主要手術方式為關節鏡下ACL重建術。ACL重建術的成功與否很大程度上取決于韌帶移植物與骨隧道之間的愈合狀況［1］，研究證明骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）及富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）對交叉韌帶重建后的腱骨愈合有明顯的促進作用［2-3］。但針對MSCs聯合PRP對腱-骨愈合的研究報道較少，該實驗利用自體MSCs聯合PRP凝膠頂端注射的方法注入骨隧道內，觀察自體MSCs復合PRP是否有促進腱骨愈合的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康成年的新西蘭大白兔24只，約2.5 kg，購自安徽醫科大學實驗動物中心。

1.1.2主要材料及試劑 兔MSCs成骨誘導分化培養基（廣州賽業生物技術有限公司）；纖維蛋白酶原、凝血酶、MSCs完全培養基、青鏈霉素（合肥欣樂生物有限公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；CO2恒溫培養箱（美國SHEL LAB）；Masson三色染色劑盒（福州邁新生物技術開發公司）。

1.2 方法

1.2.1MSCs的提取、分離及培養 粒細胞刺激因子刺激各組兔1周后，取兔外周血10 ml，1 200 r/ min離心10 min用5 ml含10%胎牛血清及1%雙抗的L-DMEM液的完全培養液沖洗離心管后接種至25 cm2培養瓶中，37℃，5%CO2恒溫箱中培養，48 h后予以第1次換液，后每72 h換液1次，待貼壁細胞鋪滿培養瓶底部90%以上后進行傳代。取生長活躍的第3代細胞進行實驗，待細胞傳至第3代后，將各組細胞消化后臺盼藍染色并在細胞計數儀上測得各兔細胞活力平均為77.34%。

1.2.2MSCs的鑒定 每日觀察細胞形態，用倒置相差顯微鏡每日觀察體外培養的MSCs增殖和形態特點，并拍照記錄。MSCs的成骨誘導鑒定：取第3代MSCs以105/孔接種于6孔板種，分為實驗組及對照組，待細胞融合80%后向實驗組加入成骨誘導液（L-DMEM，體積分數為10%胎牛血清，1%谷氨酰胺，1%雙抗，0.2%抗壞血酸，1%甘油磷酸鈉，0.01%地塞米松），對照組加入完全培養液，隔日換液，誘導3周后行茜素紅染色，并在倒置顯微鏡下觀察。

1.2.3PRP及實驗凝膠的制備 制備PRP過程嚴格無菌，造模前30 min，抽取兔外周血5～10 ml，置于含有1 ml枸櫞酸鉀15 ml離心管中，3 000 r/min離心10 min，抽取上清液，轉移至另一離心管3 000 r/min離心10 min，可見離心管中有明顯3層結構上層為貧血小板血漿，中層為富血小板血漿，下層為紅細胞。在肌腱拉入骨道固定完畢后，在1 ml EP管中分別加入纖維蛋白原與凝血酶按4∶1混合，再加入MSCs細胞懸液、PRP。即刻形成具有固體性質的生物蛋白膠。

1.2.4物模型的建立 12只新西蘭大白兔隨機分配為4組（n=24）。戊巴比妥麻醉實驗兔（1 ml∶1 kg）后，術區備皮，消毒鋪巾，取出趾長屈肌腱，將肌腱對折，對折后其直徑為（2.2±0.2）mm，長度為（15±2）mm，對折后肌腱兩游離端用無菌縫線編織縫合，折疊處用無菌絲線穿過后備用，在距折疊端3 mm處用縫線做好標記。再行髕旁內側入路，作長約20 mm的縱行切口，依次鈍性分離皮下筋膜，切開關節囊及內側支持帶，將髕骨向外拉開，切除髕后脂肪墊，顯露出前交叉韌帶，切除前交叉韌帶股骨端，保留脛骨端留作標記，用和肌腱直徑相匹配的克氏針分別鉆取脛骨及股骨骨道，骨道建立完畢后，測深尺測得股骨道長度（6±1）mm，同時在脛骨及股骨骨道旁用0.5克氏針分別水平鉆取兩骨道至對側，將編織好的肌腱兩端四線穿過無菌縫針，用縫針穿過脛骨及股骨骨道，且講連接肌腱的絲線用縫針穿過至骨干對側，將移植物股骨端拉緊至標記處到達股骨道內口處，將絲線收緊打結，屈膝30°將脛骨端收緊打結。配制MSCs及PRP凝膠，采用頂端注射的方法注入骨道內。M組注射MSCs凝膠，P組注射PRP凝膠，MP組周MSCs及PRP凝膠，C組僅注射生物蛋白凝膠。注射后用生物耳膠封閉骨道外口。多次屈伸膝關節確保韌帶穩定固定牢靠后，逐層縫合切口，無菌輔料包扎，術后未予以制動，術后前3 d常規注射抗生素。

1.2.5動物模型取材及組織學觀察 于術后第4、

8和12周3個時間點，分別隨機處4組實驗兔各2只，取重建韌帶后的膝關節，剔除關節周圍軟組織，保留重建后的前交叉韌帶，置于EDTA磷酸緩沖鹽種脫鈣6～8周后，脫鈣結束后按脫水、透明、浸蠟、包埋順序制作蠟塊，將四組關節標本蠟塊各切片10張（每只兔制作5塊切片），行Masson染色，觀察標本出現Sharpy樣纖維的數量。可以觀察到Sharpy樣纖維的切片則記為有。

1.2.64組標本組織形態學Buark評分 參照Buark評分標準，用目鏡測微尺測量各組標本切片腱-骨界面所含Sharpy樣纖維的比例。Buark評分標準為：GradeⅠ缺乏組織結構的疏松纖維血管組織界面；GradeⅡ已機化的纖維血管組織伴有膠原纖維產生，占有的界面長度＜30%；GradeⅢ成熟的纖維組織，細胞和血管減少，占有的界面長度30%～60%；GradeⅣ纖維血管組織機化成致密結締組織，垂直的骨道方向的Sharpey纖維占有的界面長度＞60%。

1.3 統計學處理采用SPSS 16.0軟件進行分析，組間數據比較采用t檢驗，等級資料采用非參數秩和檢驗及Wilcoxon秩和檢驗。設定α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 MSCs的生長及個代的形態特點原代細胞培養開始階段，細胞未貼壁，不易與其他細胞辨認，培養24 h后，可觀察到培養瓶底部有部分貼壁的、透亮的、長梭形的細胞。隨著培養時間延長，培養瓶底部貼壁細胞增多，且增殖較快，培養5 d后，貼壁細胞鋪滿瓶底，排列較整齊，少部分呈集落生長。細胞傳代后，第一代及第二代細胞生長迅速，細胞呈多形性，部分貼壁細胞周圍伸出偽足，細胞質內顆粒增多，細胞排列紊亂，第三代細胞增殖更加迅速，可見明顯集落形成，細胞呈長梭形，形態均一，排列整齊，生長旺盛。MSCs成骨誘導分化染色后可見散落在培養皿底部被茜素紅染成紅色的骨細胞。見圖1。

2.2 組織學觀察及切片數量統計M、P及MP組在術后第4周觀察可見，腱骨連接緊密，界線模糊，可見少量未成熟的軟骨樣細胞，排列較紊亂，在MP組可見部分成熟的軟骨樣細胞散在地分布于腱骨界面，并有2張切片中可觀察到Sharpy樣纖維形成，P組、M組未發現有Sharpy樣纖維形成。術后8周MP、P、M組均可見Sharpy樣纖維成分且MP組Sharpy樣纖維的含量較4周有增多的趨勢，并出現成熟的軟骨細胞，并可見軟骨化骨的過程，新生的骨質長入移植肌腱內，肌腱側大部分為成熟的成纖維細胞，而靠近骨隧道側則大部分由不成熟的成軟骨細胞構成，部分區域可見軟骨移行帶，其中MP組中成熟的軟骨樣細胞明顯多于其它兩組。術后12周，實驗組3組可見大量Sharpy樣纖維形成，纖維軟骨與鈣化軟骨增多，纖維軟骨與鈣化軟骨間有潮線相隔，形成直接止點結構；C組在術后第4周切片觀察可見大量壞死組織，腱骨間主要由血管肉芽組織連接且連接較松散，第8周腱骨界面連接較前緊密，腱骨界面多為成纖維細胞，可見少量不成熟的軟骨細胞，術后12周可見腱界面連接緊密，腱骨界面出現大量成纖維細胞和軟骨細胞且膠原纖維排列整齊，然而可見Sharpy樣纖維的切片數量僅有1張。MP組含Sharpy樣纖維切片數量與其余3組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2、3。

2.3 Buark評分結果MP組在術后12周內評分為GradeⅠ的切片數量有15張，GradeⅡ有5張，GradeⅢ有3張，GradeⅣ有7張與其余3組相比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

3 討論

關于腱骨愈合的研究報道已有很多，本研究顯示肌腱移植物移植入骨道后，短期內肉芽組織大量增生，術后約8周腱骨界面可見Sharpy樣纖維形成，被認為是腱-骨愈合的早期征象［4］。ACL直接止點有典型的4層結構：纖維組織、纖維軟骨、鈣化軟骨、骨組織。纖維軟骨與鈣化軟骨之間有“潮線”結構［5］，此結構在傳遞緩沖應力中起著重要作用。間接止點的特征性結構為Sharpy樣纖維，Sharpy樣纖維是連接肌腱與骨之間的纖維結構［6］。較為理想的腱骨愈合為直接止點愈合。本實驗中，實驗組在術后第8周組織切片染色后即可觀察到Sharpy樣纖維，術后12周Sharpy樣纖維明顯增多，并可見直接止點結構。對照組術后12周組織切片染色后才可觀察到Sharpy樣纖維。說明自體MSCs聯合PRP可以促進腱-骨愈合。

MSCs是一類存在于外周血，骨髓及臍帶血中含有多向分化潛能的干細胞，被認為是理想的“種子細胞”。研究［7-9］證明MCSs對腱骨愈合有顯著的促進作用。實驗中采取自體的MSCs及PRP，避免了異體抗原排斥反應，增加了實驗的安全性。，其中含有與創傷愈合和骨再生相關的多種生長因子，如血小板衍生生長因子、轉化生長因子β-1，2、胰島素樣生長因子、表皮生長因子和血管內皮生長因子等，這些生長因子的濃度約為全血中的17倍，其活性可持續約一周［10］。多數學者［11］認為PRP的作用源于這些因子可調節細胞分裂及分化從而可加速損傷組織的修復。研究［3，12］證明PRP在ACL重建后使得韌帶修復時間縮短48%。實驗結果也提示兩個獨立因素是可以促進腱骨愈合的。

通過本次實驗的組織形態學觀察及Buark評分的統計學分析，MSCs及PRP對腱骨愈合都有著促進作用。此次試驗結果顯示二者聯合作用是要高于獨立作用的。其機制可能與PRP加速了MSCs的分裂分化有關。MSCs在特殊條件下可以分化為多種細胞，其中PRP也有著對間充質干細胞促分化作用，研究［12］證明PRP有促進MSCs向肌腱細胞分化及加速其分裂繁殖的作用。其機制可能與PRP所含的細胞因子有關，研究［13］證明PRP中的PDGF可以促進MSCs的分泌增加細胞外基質，同時刺激其有絲分裂促進其增殖，同時表皮生長因子可協同TGF促進MSCs的分化及增殖，PRP的促分裂分化作用使得MSCs早期在骨道內得到了大量的增殖及分化加速了腱骨愈合的過程。本實驗仍存在著部分問題例如PRP是否對MSCs僅有促分化分裂作用而無拮抗作用，目前針對PPR對MSCs促分化作用仍有爭議，不同濃度的PRP對MSCs的分裂分化作用是否有著差異。此觀點會在今后的實驗中繼續探究。實驗中只觀察了腱-骨愈合的形態學，對于MSCs聯合PRP對腱-骨愈合的作用，仍需要在增加樣本量的同時深入對組織學、生物力學以及生物化學的研究，從而可以使其對腱-骨愈合的影響更具有說服力。實驗顯示，聯合使用MSCs和PRP可促進骨道肌腱早期愈合且比二者單獨使用的作用強。PRP是一種來源比較簡單且和血液中個細胞因子比例最貼近的細胞因子復合物，這些因子因子通過協同作用有效的促進了MSCs的早期分裂。實驗中PRP及MSCs均來自于自體，無異體抗原排斥反應，提取方法簡單可行，有很強的臨床應用前景。

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Effect of MSCs in combination w ith PRP on tendon-bone healing of ACL reconstuction

Yang Junjun，Xu Bin，Xu Honggang，et al
（Dept of Sports Injury Arthroscopic Surgery，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo study the effectof autologousmesenchymal stem cell（MSC）in combination with platelet rich plasma（PRP）transplantation on tendon-bone healing after anterior cruciate ligament（ACL）reconstruction.MethodsPeripheral blood the harvested from rabbits to obtain MSCs.24 adult New Zealand rabbitswere randomly divided into M，P，PM and C group（n=24）.Rabbits in M group were injected with MSCs via thrombin rabbits in P group were injected with PRP via thrombin，rabbits in MP group were injected with amixture of MSCs，PRP via thrombin，while rabbits in C group were injected with only sodium hyaluronate.Four rabbitswere killed 4，8 and 12 weeks after operaton and samples were collected for histological observation of tendon-bone healing.ResultsScar tissue with some Sharpey′s-like fiber components on the tendon-bone interface and a close tendon-bone conjugation were observed 4 weeks in MP group.As the extension of healing time after operation，Sharpy's like fiber could be observed in group M，group P，group C successively and the amount of Sharpy's like fiberwas increasing. Differences of the histomorphology Buark score of each group were significant（P＜0.05）ConclusionMSCs in combination with PRP can promote tendon-to-bone healing，and more effective than that of single factor.

mesenchymal stem cells；platelet rich plasma；anterior cruciate ligament；tendon bone healing

R 686

A

1000-1492（2016）03-0368-05

時間：2016/1/28 14：23：10 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.026.html

2015-12-08接收

安徽省自然科學基金（編號：1208085MH157）

安徽醫科大學第一附屬醫院運動創傷與關節鏡外科，合肥230022

楊軍軍，男，碩士研究生；

徐 斌，男，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：youchen100@126.com