microRNA—130a抑制KGN細胞FOXL2基因的表達及對細胞增殖的影響

李亞玲 張偉 梁惠宇 周陸陸 姚永明 唐勝建

[摘要]目的：研究外源性microRNA-130a在卵巢顆粒細胞KGN中過表達對FOXL2基因表達的影響，探索microRNA-130a對KGN細胞增殖的影響。方法：人工設(shè)計合成靶向FOXL2基因的microRNA-130a模擬物，脂質(zhì)體法將microRNA-130a模擬物轉(zhuǎn)染入KGN細胞中，Trizol法和RIPA蛋白裂解法分別獲取高純度的細胞總RNA和總蛋白，實時熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)（FQ-PCR）檢測microRNA模擬物轉(zhuǎn)染后細胞中FOXL2基因mRNA表達水平，Western Blot檢測FOXL2蛋白表達水平，四甲基偶氮唑鹽法（MTT）檢測microRNA-130a轉(zhuǎn)染后KGN細胞的增殖情況。 結(jié)果：成功轉(zhuǎn)染KGN細胞后，陰性對照組FOXL2基因mRNA和蛋白的表達水平與空白對照組相比無明顯的差異（P>0.05），miR-130a轉(zhuǎn)染組能顯著抑制FOXL2 mRNA和蛋白的表達，與空白對照組和陰性對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。MTT法檢測各組KGN細胞的OD值及細胞增值率，microRNA-10a轉(zhuǎn)染后能明顯促進KGN細胞的增殖，與與空白對照組和陰性對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。結(jié)論：外源性的miR-130a對FOXL2基因mRNA和蛋白表達有明顯的抑制作用，且能明顯促進KGN細胞的增殖。

[關(guān)鍵詞] miR-130a；轉(zhuǎn)染；KGN細胞：FOXL2；基因表達調(diào)控；細胞增殖

[中圖分類號]Q813.1

[文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2016）01-0030-04

FOXL2是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，主要表達在眼周、卵巢和垂體細胞中，該基因最早由Crisponi作為小瞼裂綜合征（BPES，Blepharophimosis Syndrome，MIM： 110100）及卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）的候選基因被克隆定位Ⅲ。小瞼裂綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，臨床上以瞼裂狹小，上瞼下垂，反向性內(nèi)眥贅皮和內(nèi)眥遠距為主要征象，BPES根據(jù)是否存在卵巢早衰分為兩型，I型合并有卵巢早衰（premature ovarianfailure，POF），II型只表現(xiàn)為眼瞼畸形，超過2/3的BPES患者攜帶有FOXL2的基因內(nèi)突變，此外FOXL2的雜合突變還能導(dǎo)致卵巢功能早衰和女性不孕。FOXL2作為轉(zhuǎn)錄因子功能的發(fā)揮需要FOXL2基因本身的磷酸化激活，發(fā)生FOXL2基因突變的體細胞FOXL2功能失活，研究證實FOXL2基因突變能夠促進細胞的增殖，以及抑制細胞的凋亡。

microRNA是生物體內(nèi)源長度約為21-25個核苷酸的非編碼小分子RNA[7]，microRNA通過與靶mRNA的3端非編碼區(qū)域（3-untranslatedregion，3UTR）互補配對導(dǎo)致mRNA的翻譯抑制或降解，從而在轉(zhuǎn)錄水平上對基因的表達進行負調(diào)控。microRNA對維持生物體正常的生理功能具有重要的意義，microRNA在體內(nèi)的異常表達與人類許多疾病有關(guān)，包括一些精神疾以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等，生物信息學(xué)研究表明生物體內(nèi)超過60%的蛋白編碼基因受體內(nèi)靶向microRNA的調(diào)控。

鑒于microRNA對基因的調(diào)控功能以及FOXL2是小瞼裂綜合癥的致病基因，本研究利用生物信息學(xué)研究工具篩查出在小瞼裂綜合癥中異常表達的microRNA，人工設(shè)計合成miR-130a mimics，將miR-130a mimics瞬時轉(zhuǎn)染入卵巢顆粒細胞KGN中，研究miR-130a mimics對FOXL2基因表達的調(diào)控作用，以及對KGN細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

KGN細胞株由濰坊醫(yī)學(xué)院整形外科實驗室保存，DMEM培養(yǎng)液、OptiMEM ReducedSerum Medium、Lipofectamine3000 Reagent、新生牛血清、MTT細胞增殖試劑均購自美國GIBCO（Invrotrigen）公司。microRNAmlmics由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司提供，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNAeraser（Perfect Real Time）和熒光定量PCR試劑MightyAmpfor Real Time（SYBR Plus）（2×）均購自日本的Takara公司，Western Blot抗FOXL2基因的一抗、二抗均購自上海優(yōu)寧維生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：人卵巢顆粒細胞癌KGN細胞株貼壁生長于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO₂恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)，實驗選取處于指數(shù)生長期的細胞。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染和熒光顯微鏡觀察：實驗分為空白對照組、陰性對照組（microRNA-130a Negative controlmlmics組）和microRNA-130a mimics轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染前24h將KGN細胞以1×lOb-3×105的數(shù)目接種于6孔板中，以每孔7.5μl的lip3 000和7.5μg的microRNA mimics轉(zhuǎn)染細胞，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于轉(zhuǎn)染8h、12h、24h、36h、48h，取出6孔板在倒置熒光顯微鏡下進行觀察。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測：轉(zhuǎn)染48h后收集每孔中的KGN細胞，按Trizol一步法提取細胞總RNA，用微量分光光度計測量RNA的濃度和純度，設(shè)計20μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中獲得的cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)對照，設(shè)計25μl PCR擴增體系，在熒光定量PCR儀按98℃5min，98℃30s，60℃30s，68℃30s，擴增40個循環(huán)。PCR擴增結(jié)束后，以2-△△Ct表示目的mRNA的相對表達量。實驗重復(fù)三次以上。

1.2.4 Western Blot檢測：細胞轉(zhuǎn)染48 h后收集各孔KGN細胞，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞并提取細胞總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。取蛋白25μg/孔，以10%SDSPAGE跑膠分離，轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫封閉2h，以FOXL2和GAPDH為一抗（抗體稀釋比例分別為1∶5000和1∶500），4℃孵育過夜，洗膜，過氧化物酶耦聯(lián)的二抗（稀釋比例均1∶500）室溫標記1h，ECL法顯影，掃描曝光后的膠片，采用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白FOXL2和內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值的比值表示目的蛋白FOXL2的相對表達水平。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖情況：取指數(shù)生長期的KGN細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后計數(shù)，按3×10¹⁰細胞/孔的濃度接種于96孔板中，置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，瞬時轉(zhuǎn)染microRNA mimics入細胞中。分別于轉(zhuǎn)染0、24、48和72h，用MTT法檢測細胞增殖情況。吸去待測細胞上清液，加入180 ll1無血清培養(yǎng)液，再加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清液，每孔加入100μlDMSO，置于搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀于490nm波長處測量各孔的吸光度（OD）值，以細胞培養(yǎng)時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞增殖曲線，計算細胞增殖率。細胞增殖率=實驗組OD值/陰性對照組OD值，繪制KGN細胞增殖率曲線。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗結(jié)果數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩樣本均數(shù)比較采用雙側(cè)t檢驗，檢驗水準為a=0.05，以P

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡觀察結(jié)果

熒光顯微鏡下，可見2種質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染8h后即可出現(xiàn)清晰的綠色熒光，24h后發(fā)生綠色熒光的細胞數(shù)目進一步增加，48h后達到最高峰，72h時熒光數(shù)量下降（圖1）。

2.2 熒光定量PCR檢測結(jié)果

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，陰性對照組FOXL2的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），miR130a轉(zhuǎn)染組FOXL2 mRNA的表達量明顯下降，與空白對照組和陰性對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。

2.3 Western Blot檢測結(jié)果

蛋白印跡法檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，陰性對照組FOXL2蛋白的表達量下降了8.796，表達量無明顯的下降，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），miR-130a轉(zhuǎn)染組FOXL2蛋白的表達量與空白對照組相比下降了40.9%，與陰性對照組相比下降了35.3%，與空白對照組與陰性對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。

2.4 MTT法檢測細胞增殖

MTT法檢測結(jié)果顯示，與空白對照組組比較，陰性對照組KGN細胞的增殖能力無明顯的改變（圖3），差異無統(tǒng)計學(xué)意義。miR-130a mimics轉(zhuǎn)染組能顯著促進細胞的增殖，與空白對照組與陰性對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P

3 討論

microRNA作為一類可調(diào)控基因表達的內(nèi)源性小分子RNA，在多種疾病中發(fā)揮重要作用，microRNA調(diào)控基因表達的功能與來源無關(guān)，microRNA調(diào)控體內(nèi)大部分的蛋白編碼基因，WANG等研究報道利用分子生物學(xué)工具預(yù)測到整個miR30家族成員都參與FOXL2基因的調(diào)控，且在COV434細胞系中敲除Ag02能夠上調(diào)FOXL2基因的表達，這項研究進一步說明，microRNA參與FOXL2基因的表達，且在實驗中證實miR_30a下調(diào)FOXL2基因的表達，miR30a通過抑制FOXL2基因的表達，上調(diào)BCL2AI和IER3基因的表達16。Dai等研究表明microRNA-133b參與FOXL2的表達，能夠通過抑制FOXL2基因的表達上調(diào)雌激素合成相關(guān)基因CYP19AI和StAR的表達，從而促進雌激素的合成。

鑒于microRNAs參與FOXL2基因的表達調(diào)控，本研究通過生物信息學(xué)工具篩查出在小瞼裂綜合征中異常表達的microRNA，人工設(shè)計合成microRNA-130a mimics，瞬時轉(zhuǎn)染入KGN細胞中，研究microRNA-130a mimics對FOXL2基因的表達調(diào)控，實驗結(jié)果表明，在KGN細胞中過表達microRNA-130a能夠顯著抑制FOXL2基因的表達，F(xiàn)OXL2mRNA和蛋白的表達量顯著下降，說明microRNA-130a參與FOXL2基因的調(diào)控，己知FOXL2基因與人類的小瞼裂綜合征以及卵巢早衰等疾病有關(guān)，參與人類的顱面部和生殖系統(tǒng)的發(fā)育，F(xiàn)OXL2是第一個被認定在維持卵巢功能中具有重要作用的常染色體基因，也是性別決定和分化的標記，F(xiàn)OXL2的突變可引起B(yǎng)PES和卵巢早衰。各種研究表明該基因在生物體中作用的發(fā)揮受到其自身表達調(diào)控的影響，而對其表達調(diào)控的研究和探索將為查明其作用的分子機制奠定基礎(chǔ)，本研究利用外源性microRNA-130a對FOXL2基因進行調(diào)控，為小瞼裂綜合征的致病基因調(diào)控提供新的研究思路。

microRNA參與細胞的增殖調(diào)控，趙等研究發(fā)現(xiàn)，miR20a在宮頸癌患者中的表達較正常人高，能夠促進宮頸癌細胞的增殖，分化與遷移。Uda等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXL2突變體小鼠的卵巢中濾泡細胞閉鎖，表明該基因在某種程度上有抗細胞凋亡的作用。FOXL2作為轉(zhuǎn)錄抑制因子能夠抑制BCL2AI、IER3和cyclinD2基因在卵巢顆粒細胞中的表達，BCL2AI和IER3是細胞凋亡抑制因子，cvclinD2是一種細胞周期調(diào)節(jié)基因，能夠促進細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)變。WANG等研究報道m(xù)iR30a通過抑制FOXL2基因的表達促進BCL2AI、IER3和cvclinD的表達，進而促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，在睪丸腫瘤和卵巢腫瘤中BCL2AI、IER3和cyclinD2基因處于高表達狀態(tài)，從而導(dǎo)致腫瘤細胞的無限增殖。基于此，本研究在microRNA-130a過表達能顯著抑制FOXL2基因表達的基礎(chǔ)上，又進一步探討microRNA-130a過表達對KGN細胞的增殖影響，MTT法檢測結(jié)果表明microRNA-130a過表達能夠明顯促進KGN細胞增殖，已知卵巢顆粒細胞參與了卵泡的發(fā)生以及雌激素的合成，卵泡細胞閉鎖能夠?qū)е侣殉苍缢ィ瑥亩l(fā)女性的閉經(jīng)、不孕不育以及一系列由于體內(nèi)雌激素缺乏所引起的癥狀，如潮熱多汗、面部潮紅等，卵巢顆粒細胞的增殖能夠減緩卵泡細胞的閉鎖，最重要的是能夠促進雌激素的合成，能明顯緩解體內(nèi)雌激素缺乏所引起的一系列臨床癥狀。

綜上所述，本研究結(jié)果表明在卵巢顆粒細胞KGN中過表達microRNA-130a，能夠顯著抑制FOXL2基因的表達，并能有效促進KGN細胞的增殖，揭示了microRNA-130a、FOXL2以及細胞增殖之間的關(guān)系，microRNA-130a對FOXL2基因的表達調(diào)控不僅為FOXL2的突變研究提供新的思路，還為FOXL2基因缺陷性疾病小瞼裂綜合征的治療提供新的治療方向，microRNA-130a通過抑制FOXL2的表達促進KGN細胞的增殖，與FOXL2基因的低表達發(fā)揮協(xié)同作用，共同促進雌激素的合成，雌激素合成量的增加能夠有效緩解小瞼裂綜合征I型中的卵巢早衰癥狀。microRNA-130a對FOXL2的表達調(diào)控具有重要的基礎(chǔ)研究價值及臨床應(yīng)用價值，而關(guān)于microRNA-130a通過何種機制促進KGN細胞的增殖則需要進一步的研究探索。