TNF—a對根尖乳頭干細胞與牙周膜干細胞增殖活性影響的比較研究

趙璐 吳佩玲 于莉 袁萍 周春梅

[摘要]目的：體外培養鼠根尖乳頭干細胞和牙周膜干細胞，比較研究腫瘤壞死因子a（TNF-a）對兩者增殖活性的影響，以期得出在炎癥狀態下兩者用于牙本質再生的可能性。方法：取幼鼠根尖尚未發育完全的健康下頜牙，用酶消化法獲得根尖乳頭干細胞和牙周膜干細胞；免疫熒光法鑒定干細胞表面標志物；將含有TNF-a濃度為O、5、10、50ng/ml的培養液加入兩者的第3代細胞中，使用MTT法檢測以比較其對兩種細胞增殖活性的影響；采用SPSS 11.O軟件包對實驗組和對照組數據進行單因素方差分析。結果：SCAP與PDLSCs均呈長梭形，形似成纖維細胞；SCAP與PDLSCs均表達干細胞特性；SCAP較PDLSCs具有更強的增殖活性；在lOng/ml和50ng/ml濃度時，TNF-a能促進2種細胞的增殖。結論：與PDLSCs比較，SCAP增殖活性更強，在炎性環境下亦是如此，根尖乳頭干細胞可能在年輕恒牙根尖周炎癥經適當治療后牙根繼續發育中起到重要作用。

[關鍵詞]TNF-a；根尖乳頭細胞；牙周膜細胞：MTT法；增殖；免疫熒光法

[中圖分類號]R781

[文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455 （2016）01-0034-03

許多臨床病例發現，己發生根尖周炎的年輕恒牙，通過嚴格的根管清理，刺激根尖區組織出血，封閉數月后可觀察根尖部分有新的硬組織形成，根尖孔閉合。但經過清理的根管中，不可能有牙髓細胞的存在。自Sonoyam從阻生智齒的根尖乳頭中分離得到根尖乳頭干細胞（stemcells from apicalpapilla，SCAP），其具有的高度增殖能力、自我更新能力和多向分化的潛能迅速使其成為牙本質再生及牙根發育的焦點。有學者將SCAP與HA/TCP復合培養后移植到免疫缺陷的小鼠皮下，觀察到皮下有牙髓牙本質樣結構形成。 據此可以推測，當患有根尖周炎癥的年輕恒牙無牙髓細胞存在時，很有可能是SCAP促使根尖繼續發育。但發育期根尖端組織涉及的干細胞種類眾多，影響因素復雜，故還無法完全確定。本研究選取幼鼠根尖尚未發育完全的健康下頜牙，分離其根尖乳頭組織和牙周膜組織進行培養，并模擬炎性環境，用炎性因子TNF-a對根尖乳頭干細胞（SCAP） 和牙周膜干細胞（PDLSCs）進行干預，研究比較炎性因子對兩者增殖活性的影響，以進一步探討SCAP在年輕恒牙發生根尖周炎時促進牙根發育的可能性。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

a-MEM培養基、胎牛血清（FBS）、PBS、青霉素/鏈霉素溶液、I型膠原酶、Vit C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉（β-Glycerophosphate Na2 Salt）、鼠腫瘤壞死性因子（TNFa）、0.25胰酶（Trypsin）、噻唑藍（MTT）、多聚甲醛、抗STR0-1多克隆抗體、二甲基亞砜（DMSO）、倒置相差顯微鏡、熒光正置顯微鏡及照相系統、37℃細胞培養孵箱、96孔板、酶標儀、超凈工作臺。

1.2 組織來源

4周齡Wistar大鼠5只，體重（60±5）g，飼養級別為清潔級，口腔牙周牙體狀況良好，遺傳背景清楚明確。

1.3 鼠SCAP和PDLSCs的分離培養和鑒定

參照郭俊等的方法取幼鼠根尖尚未發育完全的健康下頜牙，用含1%雙抗的PBS反復沖洗，無菌條件下鈍性分離根尖部的牙乳頭組織，再用刮匙刮取牙根中1/3的牙周膜組織，剪碎后分別置于15ml的離心管中，加入含3mg/ml I型膠原酶，37℃恒溫水浴消化50min，持續振蕩至完全消化；800rpm/min離心5min，棄上清液，加入含10%胎牛血清的a-MEM培養液后，分別均勻接種到10c㎡的培養皿中，在37℃、5%CO₂條件下培養，每隔3d換液。觀察細胞接近融合時，消化、傳代。采用免疫熒光法鑒定STRO-I的表達，確定兩者的干細胞特性。

1.4 TNF-a對鼠SCAP和PDLSCs增殖的影響

取第3代的SCAP和PDLSCs消化制成單細胞懸液，分別以200個/孔的濃度接種于96孔板，常規培養24h后，待大部分細胞貼壁伸展，棄孔內殘液，更換無血清a-MEM培養基饑餓培養6h后，棄殘液，分別加入含TNF-a濃度為O、5、10、50ng/ml的培養液于96孔板中，每種濃度4復孔，設調零孔，每2d換液，第4天終止培養。避光條件下每孔加入MTT（5mg/ml），37℃繼續培養4h，棄培養液，每孔加150μl DMSO，持續振蕩lOmin后，于酶聯免疫儀檢測490nm波長處各孔光密度值。

1.5 統計學分析

采用SPSSll.0軟件包，對細胞增殖數據進行單因素方差分析（ANOVA），比較各組間樣本均數的差異，P

2 結果

2.1 鼠SCAP和PDLSCs的生長及形態觀察

原代培養3d后，倒置顯微鏡下可觀察到SCAP向組織周圍游離生長出來。細胞形態多數呈長梭形，少數為多角形、紡錘狀或橢圓形，體積較小（圖1），每3d全量換液，6-8d后傳代，傳代后細胞整體呈漩渦狀排列。加入TNF-a后，SCAP細胞形態未發生明顯改變，但細胞密度明顯增加。

原代PDLSCs形態與SCAP形態相似，呈成纖維細胞樣的梭形結構，但體積較SCAP短小（圖2），傳代后呈漩渦狀生長。加入TNF-a后，PDLSCs細胞形態亦未發生明顯改變。

2.2 干細胞特征的鑒定

免疫熒光法鑒定，鼠SCAP和PDLSCs均呈STRO-1強陽性表達（圖3、圖4），符合間充質來源的干細胞的特性。

2.3 TNF-a對鼠SCAP和PDLSCs增殖的影響

TNF-a作用兩種細胞4d后，TNF-a對SCAP和PDLSCs增殖活性的影響結果見表1。在lOng/ml和50ng/ml濃度時，TNF-a能明顯促進SCAP和PDLSCs的增殖，與對照組O濃度相比差異具有統計學意義（P<0.05），而每種細胞在lOng/ml和50ng/ml濃度時，TNF-a的2種濃度組的組間比較，無顯著差別（P>0.05）。在未加入TNF-a時，SCAP較PDLSCs具有較強的增殖活性（P<0.05）。

3 討論

眾所周知，臨床上患有根尖周炎的恒牙，在經過徹底清理，系統的根管治療后，根管中是不可能存在牙髓細胞的。而通常在臨床上遇到患有根尖周炎癥的年輕恒牙時，醫師們一般使用氫氧化鈣以達到根尖誘導的目的。此方法在不同病例上獲得的效果不一。研究發現年齡小、病史較短的患牙的治療效果較好，究其原因可能是病史較長的患牙根尖部形成硬組織的細胞受到破壞。但近年來許多病例發現：患有根尖周炎的年輕恒牙，在經過根管治療后，牙根持續發育成形，且部分病例牙髓活力測試有反應。據此，有學者提出了“血管重建假說”，他們認為之所以年輕恒牙發生炎癥后牙根仍能夠繼續發育是因為其擁有寬大的管腔，當發生根尖周疾病時，由于通暢的血液循環，根尖處也許仍存在部分干細胞，可發生牙髓再生及根尖成形。據此可推測發育期牙根的根端組織可能作為牙根發育的生長和調控中心，并長期存在于發育期牙根的根端。SCAP的問世正好證實了這一假說。與牙髓干細胞（DPSCs）相比，其增殖能力、端粒酶活性及細胞遷移能力均強于DPSCs。但由于根端組織涉及的干細胞非常多，如上皮根鞘細胞、根尖乳頭干細胞、牙囊干細胞、牙周膜干細胞等，故還無法完全確定。同時，患有根尖周炎癥的年輕恒牙，根端組織暴露于炎癥環境下，故了解根端組織的干細胞在炎癥環境下的生物學特性尤為重要。本研究模擬體內炎癥環境，用炎性因子TNF-a對根尖乳頭干細胞和牙周膜干細胞進行干預，對比研究TNF-a對兩者增殖影響。

腫瘤壞死因子a（TNF-a）是一種由激活的巨噬細胞產生的炎性介質，在發生齲病、牙髓炎及根尖周炎的組織中高表達，而健康組織幾乎不表達，是參與炎癥發生發展十分重要的一種細胞因子。Yang H等發現TNF-a可促進SCAP細胞增殖。本研究結果顯示在lOng/ml和50ng/ml兩種濃度的TNF-a對SCAP和PDLSCs的增殖均有明顯的促進作用，但對同一細胞的兩種濃度間差異無統計學意義。這一特點為牙組織工程學優良種子細胞的篩選提供了廣闊的前景；對年輕恒牙根尖周炎癥的治療帶來了新的希望。但由于本實驗涉及的實驗對象為Wistar大鼠，無法確定TNF-a對于人的牙齒與鼠的影響是否具有差異，故在炎癥條件下根尖乳頭干細胞促使人牙本質再生的效果，還需進一步進行大量的實驗研究和臨床試驗。