補益營衛方對衰老小鼠皮膚端粒酶表達的影響

司曉偉 周小平

[摘要]目的：觀察補益營衛方對衰老小鼠皮膚端粒酶表達的影響，探討補益營衛方延緩皮膚衰老的機制。方法：以自然衰老小鼠為模型，制備石蠟切片，應用免疫組化法對端粒酶的表達進行分析。結果：衰老小鼠皮膚中端粒酶的表達水平較年輕小鼠低，且有顯著性差異（P<0.05）。應用補益營衛方高、中、低劑量組處理后，可顯著提高端粒酶的表達，與老齡模型組比較有統計學意義（P<0.05）。三個劑量組相比，低劑量組對端粒酶表達水平的影響優于其它兩個劑量組（P<0.01），中劑量組和高劑量組相比沒有明顯差異（P>0.05）。結論：補益營衛方通過促進衰老皮膚端粒酶的表達，起到延緩皮膚衰老作用。

[關鍵詞]營衛；皮膚衰老；端粒酶；中醫藥；機制

[中圖分類號]Q591

[文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2016）01-0041-03

中醫理論認為營衛具有“熏膚、充身、澤毛、溫分肉、充皮膚、肥腠理、司開合”的作用，其與皮膚的生理和病理有密切關系。隨著年齡的增加，人體氣血漸衰，營衛亦顯不足，皮膚顯現衰老的表象。端粒酶（Telomerase）是一種在細胞中負責端粒延長的酶，端粒在不同物種細胞中對于保持染色體穩定性和細胞活性有重要作用，許多研究表明，端粒酶除具有合成端粒重復序列，防止細胞復制性衰老的作用以外，還具有獨立于端粒外的抗凋亡作用和調節細胞生存的作用。本實驗擬通過對衰老小鼠皮膚端粒酶的影響，探討補益營衛方延緩皮膚衰老的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康清潔級C57BL/6種雌性小鼠50只，其中3月齡10只，重量（20±2）g，14月齡40只，重量（28±3）g，實驗動物合格證號：SYXK（蘇）2011-0035，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供。飼養于寧夏醫科大學動物實驗中心。

1.2 實驗藥物

補益營衛方由人參、甘草等組成，購自寧夏醫科大學中醫門診部，常規水煎2次，合并濾液濃縮至生藥含量1g/ml，4℃冷藏保存。灌胃時用生理鹽水稀釋至所需濃度。

1.3 主要實驗儀器與實驗試劑

LEICA RM2245石蠟切片機（德國徠卡公司），LEICAEG1150C組織包埋機（德國徠卡公司），Glanz WD800微波爐（廣東格蘭仕有限公司），Olympus光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）等均有寧夏醫科大學解剖實驗室提供。端粒酶相關一抗和二抗（abcam公司），DAB顯色劑（中杉生物有限公司）等。

1.4 分組、給藥、取材

清潔級C57BL/6種雌性小鼠50只，其中3月齡10只，設為年輕組；14月齡40只，隨機分為4組，每組10只，分別設為老齡模型組、補益營衛高劑量組、中劑量組和低劑量組。補益營衛方高、中、低劑量組每天分別按6g/kg、39/kg、1.5g/kg的劑量灌胃給藥，每周禁食稱重一次，連續六周。六周后，脫臼處死動物，剪下背部皮膚，盡可能剪去背毛，取1.Ocm×1.Ocm，分成數份，置于4%多聚甲醛中固定，將固定標本取出，常規脫水，透明，浸蠟后包埋，石蠟切片厚度為5μm。

1.5 實驗方法

本次實驗通過免疫組化法對小鼠皮膚端粒酶表達的檢測，具體過程如下：①5μm石蠟切片脫臘入水；②枸櫞酸緩沖液加熱至90℃，微波修復Imin后冷卻，移至PBS；③PBS漂洗5min×3次；④加20%正常牛血清，室溫留置30min；⑤加100μlTdT反應混合液，置濕盒中，37℃反應90min；⑥PBS漂洗5min×3次；⑦浸入0.3%過氧化氫甲醇液，室溫阻斷lOmin；⑧PBS漂洗5min×3次；⑨加POD轉化劑，37℃反應30min；⑩PBS漂洗5min×3次； 11.加100μlDAB顯色；12.蘇木素復染，常規脫水、透明、中性樹膠封片。

1.6 指標測定

光鏡下細胞核呈棕色顆粒為陽性細胞。每張切片在高倍鏡視野下選擇對照背景較好，陽性細胞表達最強的染色部位，細胞分布較為均勻的10個視野，應用Image-ProPlus 6.0進行圖像分析，用光密度值評價端粒酶。

1.7 統計學處理

應用SPSSII.5進行數據統計分析，實驗數據用x±s表示，樣本均值比較采用單因素方差分析，方差分析采用LSD法比較各組均數間的差異。顯著性水平設為a=0.05，P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

見圖1。結果顯示，在光學顯微鏡下，端粒酶表達的陽性細胞的胞核呈棕黃色，陰性細胞呈淡藍色。年輕組小鼠皮膚端粒酶表達強，主要分布在表皮基底層及毛囊部位；而老齡模型組端粒酶的表達則明顯較弱，兩組之間有顯著差異（P<0.05）。應用補益營衛方不同劑量組處理后，可顯著提高衰老小鼠皮膚端粒酶的表達，與老齡模型組比較有顯著差異（P<0.05）。補益營衛方三個劑量相比，低劑量組對端粒酶表達水平的影響優于其它兩個劑量組，并有顯著統計學意義（P<0.01），中劑量組和高劑量組之間無統計學差異（P>0.05）。見表1。

3 討論

隨著人類社會的發展和進步，人們生活質量逐漸提高，對延緩皮膚衰老的要求越來越迫切。皮膚衰老作為機體衰老的重要組成部分，最先表現于外，衰老的皮膚外觀不但影響容貌靚麗，亦影響社交，因此預防和延緩皮膚衰老已成為美容醫學研究的熱點。中醫藥在數千年的發展中積累了豐富的抗衰老理論和經驗，《傷寒論·平脈法》第69條說：“寸口脈微而澀，微者衛氣衰，澀者榮氣不足，衛氣衰，面色黃，榮氣不足，面色青。”指出營衛充盛，則肌肉健壯，容光煥發，沒有衰老之象；反之，營衛不足，則面色青黃，衰象顯露。因此皮膚的健康，疾病以及衰老與營衛密切相關。

筆者從《傷寒論》和《金匱要略》中與營衛相關方劑的挖掘、整理與分析，從以“營氣不足”導致身疼痛為病機的桂枝新加湯證中選取益營氣的人參，從治虛勞的黃芪建中湯證選取益衛的生黃芪，再加益氣調和藥性的炙甘草組成了補益營衛方。本實驗從補益營衛的角度出發，探討補益營衛方對衰老皮膚中端粒酶的表達影響。

近年研究表明，端粒和端粒酶在細胞復制性衰老中起著重要作用。正常體細胞端粒的長度是有限度的，隨著年齡的增長和細胞分裂次數的增多，端粒會逐漸縮短，一般丟失速度為50-200bp/次。端粒長度決定了細胞的分裂次數，它作為有絲分裂的“時鐘”，調控著細胞的復制壽命，超過分裂極限后細胞自然衰老死亡。

端粒酶是一種能延長端粒末端、由RNA和蛋白質組成的核糖核蛋白酶。端粒酶結構組成主要包括三部分：人類端粒酶RNA基因（human telomerase RNA component，hTerc），人類端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTert），Dyskerin。有研究發現，激活端粒酶活性可以阻止端粒縮短引起的衰老，延緩組織老化并提升機體的健康狀況及生命長度。國內外研究表明，端粒酶與衰老有密切的聯系，因此對端粒酶的檢測對抗衰老有著重大意義。

本研究采用免疫組化技術通過對衰老小鼠皮膚端粒酶的表達，探究補益營衛方延緩皮膚衰老的機制。實驗結果顯示，衰老小鼠皮膚中端粒酶的表達水平比年輕小鼠的表達水平明顯下降，兩者之間有顯著統計學意義（P<0.05）。與國內外的報道相符。經補益營衛方高、中、低劑量組干預，對衰老小鼠皮膚端粒酶的表達有促進作用，與老齡模型組比較有顯著差異（P0.05）。

綜上所述，可以看出補益營衛方通過促進衰老皮膚端粒酶的表達而延緩皮膚衰老。