歐美楊PdSIKI基因的克隆與功能分析

楊李嬌,郭 鵬,許涵杰,郭 鵬　(大連民族大學，遼寧大連 116600)

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歐美楊PdSIKI基因的克隆與功能分析

楊李嬌,郭 鵬,許涵杰,郭 鵬*(大連民族大學，遼寧大連 116600)

摘要[目的]篩選抗旱節水歐美楊品種。[方法]以歐美楊為材料，通過RT-PCR方法從歐美楊葉片中克隆到抗旱PdSIKI基因，將其轉入擬南芥中，研究轉PdSIKI基因擬南芥的表型性狀和生理指標。[結果]PdSIKI基因開放閱讀框為2 442 bp，編碼813個氨基酸。蛋白質分析表明PdSIKI蛋白含有典型的類受體蛋白激酶高度保守的絲氨酸/蘇氨酸結構域和跨膜區域。熒光定量PCR分析表明該基因在頂端葉中表達量最高，功能葉、根和莖中則無表達。逆境脅迫分析表明該基因受NaCl、ABA和干旱誘導表達明顯。與野生型相比，干旱處理下轉PdSIKI基因擬南芥表現出更強的生長狀態，且葉綠素含量降低，丙二醛含量升高。[結論]超表達PdSIKI基因提高了擬南芥抗干旱能力。

關鍵詞歐美楊；PdSIKI基因；克隆； 表達；干旱

歐美楊107(Populusdeltoides×Populusnigra)是我國1984年從引自意大利的“美洲黑楊×歐洲黑楊”無性系中選育而成，適合我國淮河、黃河流域及遼河流域以南地區種植，也適合西北地區種植。其材性良好，桿型優美，樹冠窄，側枝細，葉滿冠，抗病蟲，抗風折。近年來我國引進了許多優良歐美楊無性系用于營造大面積的速生豐產林并取得很好的經濟和社會效益，但高耗水量的缺點限制了其進一步推廣。除采取工程手段外通過分子生物學手段改良歐美楊的綜合抗逆性、培育抗逆新品種，已成為我國乃至世界農林業持續高效發展的重大課題之一[1]。

蛋白激酶是一類催化蛋白質磷酸化反應的酶，它能把腺苷三磷酸(通常是ATP)上的γ-磷酸轉移到蛋白質分子的氨基酸殘基上。植物類受體蛋白激酶在植物體內起著重要的信號轉導作用,幾乎參與所有的細胞代謝過程,包括植物細胞抗逆反應[2]、植物形態發生[3]、自交不親和[4]等生理生化反應。目前已從多種高等植物中分離出一系列受體蛋白基因,并分析了其基因特征和表達特性[5-8]。OsSIK1是從水稻中克隆到的一種類受體蛋白激酶基因，超表達該基因明顯提高了水稻的抗旱和抗鹽能力[9]。該基因具有典型的類受體蛋白激酶和跨膜區域的特點，且受多種逆境脅迫誘導。筆者通過RT-PCR方法從歐美楊葉片中克隆到同源SIK1基因——PdSIKI，將該基因轉入擬南芥，研究轉基因擬南芥的抗旱能力，旨在為探究PdSIKI基因在歐美楊抗旱過程中信號轉導的角色，以及為歐美楊定向遺傳改良和品種創新提供理論依據和基因資源。

1材料與方法

1.1材料供試材料為歐美107速生楊(Populus×euramericanacv．‘74/76’)。將歐美楊扦插苗種植在20 L花盆中，在溫室中自然生長60 d，期間每3 d充分澆水并外施草炭土以保證其快速生長。

1.2PdSIKI基因的克隆通過毛果楊基因組網站http:∥genome． jgi-psf． org /Poptr1_1/Poptr1_1.home.html搜索到OsSIK1同源基因010G157400.1(別名：Pt-SIK1.1)。以總 RNA 為模板，使用 M-MLV Reverse Transcriptase 進行反轉錄，合成 cDNA 第 1 鏈，作為模板用于擴增PdSIKI基因。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，34循環；72 ℃再延伸10 min；4 ℃終止。PdSIKI上游引物：ATGTCGGGTCTGGATCAACCATCCC，PdSIKI下游引物：CTAATCACAAAGATTTTGAATGGTTTGT。

1.3PdSIKI基因的表達分析選取3株長勢類似的歐美楊分別進行以下處理：①鹽處理。用2 L 300 mmol/L NaCl溶液進行澆灌，并分別在0、2、4、6 h摘取頂端葉片置于液氮中，然后在-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。②干旱處理。將歐美楊放于室外自然干旱，并分別在0、2、4、6 h摘取頂端葉片置于液氮中，然后在-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。③ABA處理。用250 mmol/L ABA溶液進行處理0、2、4、6 h，在-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。組織特異表達分析：提取未脅迫處理的植株頂端葉、功能葉、莖和根置于液氮中，然后在-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。分別提取其總RNA 反轉錄成cDNA 用于熒光定量PCR 分析。特異引物ER5: 5′-AGGAACCTTTGGAAGAGTATCAAAT-3′，ER3: 5′-TGGATATCATGAACAAAACCCTCAT-3′。每種處理重復3～5次。

1.4轉PdSIKI基因擬南芥的功能分析利用農桿菌介導的方法進行擬南芥的遺傳轉化，將所收獲的T1代種子消毒后平鋪于含50 μg/mL潮霉素的MS選擇培養基中；14 d后挑選轉化體轉入MS培養基中，7 d后轉入土壤中生長；收獲T2代種子，利用PCR鑒定陽性植株并進行觀察和生理鑒定。參照趙世杰等[10]的方法測定干旱處理下野生型和轉基因擬南芥的葉綠素和丙二醛(MDA)含量，重復3～5次。

2結果與分析

2.1PdSIKI基因的克隆利用毛果楊基因組數據庫(http://genome.jgi-psf.org/Poptr1_1/Poptr1_1.home.html)以歐美楊葉片的cDNA 為模板，設計特異引物進行PCR 擴增。通過RT-PCR反應，獲得歐美楊同源SIK1基因，命名為PdSIKI。該基因編碼閱讀框為2 442 bp，編碼813個氨基酸。與毛果楊SIK1基因核苷酸和氨基酸的同源性分別為95.75%和93.07%(圖1)。

2.2PdSIKI 蛋白質預測和跨膜分析通過SMART軟件預

測PdSIKI蛋白結構具有典型的類受體蛋白激酶的特點。利用TMpred軟件分析表明， PdSIKI的大部分氨基酸殘基都在零點以下，具有高度親水性，少部分在零點以上，具有疏水性。另外，PdSIKI有一個明顯的跨膜結構(圖2)。

2.3PdSIKI基因的表達分析由圖3可知，PdSIKI基因在頂端葉中表達量最高，而在功能葉、莖、根無表達。為了進一步了解PdSIKI基因在不同脅迫條件下的表達,利用熒光定量PCR對歐美楊PdSIKI基因的表達進行了分析。由圖4可知，在干旱脅迫處理下,PdSIKI基因被誘導表達明顯,處理2 h 時表達量達到最大,約為對照的5倍;在鹽處理下,PdSIKI基因被誘導表達明顯，處理4 h時表達量達到最大，約為對照的6倍；在ABA處理下，PdSIKI基因被誘導表達明顯,處理4 h 時表達量達到最大,約為對照的7倍。

2.4轉基因擬南芥的表型性狀將生長7 d的轉基因擬南芥和野生型幼苗置于干旱處理下，結果顯示，與野生型相比，轉基因擬南芥在干旱處理10和20 d下表現出更強的生長狀態(圖5)。

2.5轉基因擬南芥的生理指標由圖6可知，干旱處理(土壤飽和含水量的20%)后，野生型和轉基因株系的葉綠體含量均降低，但轉基因株系的葉綠素含量相對野生型降低較少。其中野生型葉綠素含量降低了72%，T2-2降低了60%，T2-6降低了49%，T2-10降低了56%。

在未脅迫處理的植株中，轉基因植株的MDA含量與野生型相比無顯著差別，而干旱脅迫處理后，MDA含量均升高。野生型中MDA含量高于轉基因株系，其中野生型MDA含量是T2-6株系的1.6倍，這說明在干旱脅迫處理下轉基因植株膜脂過氧化程度較輕。

3結論與討論

干旱等非生物脅迫嚴重限制了歐美楊的進一步推廣和應用，隨著分子生物學的發展，研究抗逆相關基因的分子表達調控機制已成為當前楊樹抗逆品種培育的重要手段[9-11]。類受體蛋白激酶作為脅迫表達相關基因的一部分參與植物體應答逆境與防御相關的過程,受到極大的關注。該研究從歐美107速生楊葉片中克隆到SIKI同源基因—PdSIKI。該基因編碼閱讀框為2 442 bp，編碼813個氨基酸。通過SMART軟件預測PdSIKI蛋白結構具有典型的類受體蛋白激酶的特點。利用TMpred軟件分析表明， PdSIKI的大部分氨基酸殘基都在零點以上，具有高度親水性，少部分在零點以下，具有疏水性。另外，PdSIKI有一個明顯的跨膜結構。

PdSIKI基因的組織特異性表達特征表明該基因在頂端葉中表達量最高，而在功能葉、莖、根無表達。該結果暗示PdSIKI基因與其他蛋白激酶一樣參與植物的生長發育。為了進一步了解PdSIKI基因在干旱脅迫下的分子機制，利用熒光定量PCR對歐美楊PdSIKI基因的表達進行了分析。結果表明，PdSIKI在干旱、高鹽、ABA等逆境脅迫下表達量均升高。其中，在ABA處理下PdSIKI基因快速積累并在4 h達到峰值，說明該基因參與了ABA途徑的信號轉導模式。在鹽脅迫處理下，PdSIKI基因被誘導表達明顯，處理4 h時表達量達到最大，約為對照的6倍；在干旱處理下，PdSIKI基因被誘導表達明顯，在處理2 h時達到最大，約為對照的5倍，這暗示其參與滲透調節作用。大量研究表明受體蛋白激酶復合物之間相互作用從而傳遞信號,受體蛋白激酶聚合成二聚體或寡聚體是其激活的必要條件,以單體形式存在的類受體蛋白激酶不具有活性。如植物激素油菜素類固醇(brassinosteroid,BR) 的信號轉導需要BRI1 和BAK1 之間相互作用組成受體復合物才能完成[12-15]。因此，PdSIKI基因參與逆境脅迫信號轉導的網絡可能采取類似的模式。但蛋白激酶之間的相互作用以及在各自所處的信號轉導系統中的地位尚不明確，需要進一步研究。

為了進一步驗證PdSIKI的抗旱性，對干旱脅迫下轉基因和野生型擬南芥的葉綠體含量進行比較，結果發現轉基因的3個株系都具有較高的葉綠素含量，表明PdSIKI明顯減弱了干旱脅迫對植物光合機構的損害。MDA含量升高說明PdSIKI明顯提高了擬南芥的抗細胞過氧化能力。

該研究通過歐美楊PdSIKI基因的克隆與功能研究，為進一步了解受體蛋白激酶在植物逆境脅迫分子反應機制以及下一步的轉基因楊樹研究奠定理論基礎。

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Cloning and Functional Analysis ofPdSIKIfromPopulusdeltoides×Populusnigra

YANG Li-jiao,GUO Peng,XU Han-jie,GUO Peng*

(Dalian Nationalities University,Dalian, Liaoning 116600)

Key wordsPopulusdeltoides×Populusnigra;PdSIKI; Cloning; Expression; Drought stress

Abstract[Objective] The aim was to screen out drought resistance and water-savingPopulusdeltoides×Populusnigravarieties.[Method] WithPopulusdeltoides×Populusnigraasmaterials,drought resistancePdSIKIgene was cloned fromPopulusdeltoides×Populusnigraleaves with RT-PCR method then transferred into Arabidopsis thaliana, the phenotypic traits and physiological indicators were studied.[Result] The cDNA ofPdSIKIwas 2 442 bp and contained a single open reading frame of 813 amino acid residues.Protein sequence analysis showed thePdSIKIhas a serine/threonine protein kinase domain and transmembrane.Real time-PCR indicated that the mRNA accumulation ofPdSIKIwas strongly expressed in immature leaves,but not in functional leaves,roots and stem and induced by salt stress,ABA and drought.Additionally,compared with the control,transgenicPdSIKIarabidopsis performed stronger growth status. Chlorophyll content decreased and MDA content increased in drought stress.[Conclusion]PdSIKIgene can improve drought resistance ability ofArabidopsisthaliana.

基金項目科技部火炬計劃項目(2012GH531899)；科技部星火項目(2013GA651006)。

作者簡介楊李嬌(1993- )，女，云南大理人，本科生，專業：生物技術。*通訊作者，講師，博士，從事植物抗逆學研究。

收稿日期2016-02-25

中圖分類號S 718.3

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)07-098-05