大鼠下丘腦室旁核雌激素受體和一氧化氮合酶共存表達的年齡變化

趙　晨　　王瑞峰　　趙云鶴　　楊桂姣▲.太原市公安局小店分局刑偵大隊技術中隊，山西太原　000；.西安交通大學醫學院，陜西西安　7006；.山西醫科大學解剖教研室，山西太原　0000

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大鼠下丘腦室旁核雌激素受體和一氧化氮合酶共存表達的年齡變化

趙晨1王瑞峰2趙云鶴3楊桂姣3▲
1.太原市公安局小店分局刑偵大隊技術中隊，山西太原030032；2.西安交通大學醫學院，陜西西安710061；3.山西醫科大學解剖教研室，山西太原030001

[摘要]目的觀察大鼠下丘腦室旁核（PVN）雌激素受體（ER）及一氧化氮合酶（NOS）陽性細胞共存表達的數量和分布趨勢，探討其隨年齡而變化的規律。方法取生后10 d齡、20 d齡、30 d齡、60 d齡、90 d齡SD大鼠，每組5只，取下丘腦部位腦組織行冠狀切片，采用免疫組織化學技術與還原型輔酶Ⅱ-黃遞酶（NADPH-d）組織化學法，觀察PVN內NOS/ER雙標陽性細胞在各個年齡組的表達情況。結果生后10 d組SD鼠PVN內小細胞部腹內側NOS及ER共表達細胞較密集，約（31.85±2.01）％，小細胞部后外側區NOS及ER共表達細胞分布散在，突起不明顯，隨著年齡的增長雙染細胞數目增多，突起延長。在生后20 d組約為（35.16±1.99）％，30 d組約為（43.83±3.13）％，60 d組約為（60.11±2.27）％，到生后90 d組SD鼠NOS及ER共表達細胞達（82.78±2.14）％（F=79.755，P＜0.05）。結論①SD大鼠出生后各發育階段下丘腦PVN內ER和NOS皆有共存表達，且分布逐漸向內側部遷移；②SD大鼠雌激素水平對下丘腦PVN內NOS陽性細胞表達起正向調控。

[關鍵詞]一氧化氮合酶；雌激素受體；室旁核；發育

機體維持內環境穩定的重要途徑之一是神經內分泌調節，如下丘腦-垂體-性腺軸的調控，對于內環境穩定非常重要，而神經內分泌調節的高級中樞是下丘腦[1，2]。雌激素通過與其受體結合影響腦內神經元結構和功能，在促進神經元的增殖、分化、存活、以及維持神經元的正常功能等方面均起重要作用[3-7]。人類隨著年齡增長，激素水平產生變化，可能影響機體的神經內分泌功能。一氧化氮（NO）是神經內分泌網絡系統調節的重要信使分子，既可作為神經調質，促進釋放神經遞質[8]；其本身又有神經遞質的作用，可通過影響下丘腦-垂體-性腺軸，參與調節整個身體內環境的平衡[9]。NO合成的關鍵因素是一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS），NOS表達可間接反映NO的分布[10-13]。研究發現在下丘腦室旁核有NOS和雌激素受體（estrogen receptor，ER）共存表達[14，15]，但ER和NOS相互作用的功能及機制尚不清楚，且隨年齡變化大鼠室旁核ER/NOS共表達的趨勢國內鮮有報道。因此，本課題采用雙標法，觀察SD大鼠下丘腦室旁核在生后不同年齡階段ER和NOS陽性神經元的共存表達，并進一步研究一氧化氮與雌激素的相互作用，以期為預防和治療年齡相關性退行性疾病提供新靶點和新思路。

1　材料與方法

1.1實驗動物

健康成年SD大鼠，山西醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：山醫字第070101號，12只，雌雄各半，體重250～300 g，配對繁殖小鼠。小鼠出生日為生后第1天，取生后不同發育階段10 d、20 d、30 d、60 d、90 d齡的SD大鼠，每組5只，共計25只。實驗于2013年10月～2014年9月在山西醫科大學人體解剖學科研實驗室和山西醫科大學科研實驗中心完成。

1.2冰凍切片

1％戊巴比妥鈉麻醉大鼠（40 mg/kg），生理鹽水、4％多聚甲醛、灌注取腦，4％多聚甲醛后固定，15％、30％蔗糖溶液脫水。取下丘腦，冠狀面冰凍切片，片厚40 μm。

1.3黃遞酶（NADPH-d）與ER雙標染色

（1）黃遞酶（NADPH-d）組織化學染色切片在0.01 mol/L PBS液中漂洗5 min×3次后，正常山羊血清37℃恒溫箱封閉1 h；（2）一抗（1∶50；兔抗鼠ER抗體），4℃過夜，0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次；（3）生物化二抗溶液，37℃1 h，PBS洗5 min×3次；（4）辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37℃1 h，PBS漂洗，步驟同上；（5）DAB反應液顯色；（6）常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；（7）對照組用正常兔血清代替兔抗ER血清。

1.4結果分析

依照大鼠腦立體定位圖譜[16]，選各組切片中下丘腦室旁核部位，在明場下用Olympus BX51顯微鏡觀察，拍照，捷達801圖像分析系統計數，分析在單位面積內ER及NOS陽性神經元數目，計算雙染陽性細胞百分率，并進行統計學分析。

1.5統計學方法

2　結果

2.1ER和NOS染色陽性細胞形態

ER陽性細胞呈棕黃色，卵圓形，胞漿不著色，胞核著色，大多數著色較淺，但細胞輪廓清晰，分布較密集，突起不明顯，偶可見較短突起。NOS陽性細胞呈藍黑色或藍色，細胞核不著色，胞質著色，突起較短。見圖1。

圖1　大鼠生后NOS與ER雙染細胞在下丘腦PVN的表達

表1　下丘腦PVN內ER和NOS的表達（±s）

表1　下丘腦PVN內ER和NOS的表達（±s）

注：30 d組、60 d組、90 d組ER+NOS+與10 d組比較，t=3.216，9.298，17.332，*P＜0.05；60 d組、90 d組ER+NOS+與20 d組比較，t=8.249，16.293，aP＜0.05；10 d組、60 d組、90 d組ER+NOS+與30 d組比較，t=-3.216，4.202，10.261，bP＜0.05；10 d組、20 d組、30 d組、90 d組ER+NOS+與60 d組比較，t=-9.298，-8.249，-4.202，7.253，cP＜0.05；10 d組、20 d組、30 d組、60 d組ER+NOS+與90 d組比較，t=-17.332，-16.293，-10.261，-7.253，dP＜0.05

ER（個）NOS（個）ER+NOS+（％）F值P值（vs 10 d）P值（vs 20 d）P值（vs 30 d）P值（vs 60 d）P值（vs 90 d）120.1±13.05 112.5±25.96 31.8±2.01 0.328 0.001b0.000c0.000d136.7±13.09 99.4±8.84 35.1±1.99 0.328 -0.15 0.000c0.000d143.3±9.54 103.4±16.14 43.8±3.13*79.755 0.001*0.15 -0.000c0.000d129.7±14.69 87.2±9.08 60.1±2.27*0.000*0.000a0.000b-0.000d114.3±12.66 82.7±9.77 82.7±2.14*0.000*0.000a0.000b0.000c-組別　10 d　20 d　30 d　60 d　90 d

圖2　大鼠下丘腦室旁核ER和NOS變化直方圖

2.2大鼠生后隨年齡變化NOS與ER雙染細胞在下丘腦PVN的表達情況

室旁核（Paraventricular nucleus，PVN）位于第三腦室下丘腦部的上端兩側，是下丘腦前區最顯著的核團之一，可分為大細胞部、小細胞部和背側帽部等部位。生后10 d組，雙染細胞大多為深藍色胞漿，棕黃色胞核，少量細胞的胞漿著色較淺，胞核較大，于小細胞部腹內側區域雙染細胞分布較為密集[占細胞總數（31.8±2.01）％；見表1、圖2]，于大細胞部后外側區域呈散在分布（圖1①，②）。生后20 d組，雙染細胞形態與10 d組相似，細胞呈卵圓形或梭形，較低齡組（生后10 d組）神經元突起延長。小細胞部可見散在的橢圓形或卵圓形，無明顯突起，輪廓較為清晰的ER陽性細胞，分布于密集的雙染陽性細胞之間[約為總細胞數的（35.1±1.99）％]（圖1③，④；表1、圖2）。生后30 d組，細胞突起較生后20 d增長，小細胞部部雙染細胞增多，占細胞總數（43.8±3.13）％，NOS陽性細胞突起明顯增長（圖1⑤，⑥；表1、圖2）。生后60 d組，雙染陽性細胞較密集分布于小細胞部腹內側區域，散在分布于大細胞部后外側區。細胞的分支比較多，突起較短而粗，在一些區域交織成叢。雙染陽性細胞的突起在小細胞部的腹內側區域不容易辨別，多和附近的細胞突起交錯混雜。雙染細胞占小細胞部細胞總數的（60.10±2.27）％，少數雙染陽性細胞，胞體較大，核仁濃染，橢圓形的細胞截面，不明顯的突起，散在地分布在大細胞部的后外側區（圖1⑦，⑧；表1、圖2）。生后90 d組，雙染陽性細胞突起延長，細胞形態較成熟，雙染細胞占小細胞部細胞總數的80％以上（圖1⑨，⑩；表1、圖2）。

3　討論

已有文獻報道，雌激素和一氧化氮共同作用可影響人體心血管功能[17]。而雌激素亦可通過血腦屏障，與受體結合，進而影響腦的功能，有報道表明，雌激素可調節腦內特定神經元的分化，亦可營養膽堿能神經元，發揮神經生長因子輔因子的作用[18，19]。哺乳動物出生后，雌激素水平隨著年齡變化很大，老年動物雌激素水平大幅降低，而老年神經退行性疾病高發。下丘腦是神經內分泌系統的高級中樞，幫助維持機體的內環境平衡，具有調節體溫、調控血漿滲透壓、情緒、調節水攝取及血容量、調節攝食及代謝，調控生殖等功能，是間腦的一部分，為大腦基部相對較小的區域[20]。NOS陽性神經元參與和介導了下丘腦的功能，可促進釋放神經遞質，并作為第二信使介導興奮性氨基酸的功能，參與長時程增強電位的形成，NOS還參與失活花生四烯酸的過程，以及在基因修飾和蛋白質修飾中發揮作用，與神經的發生，衰老和死亡等重要生物活性相關[21]。那么，阿爾茨海默病、帕金森癥等年齡相關性疾病是否與雌激素以及一氧化氮表達水平相關呢？

本實驗發現大鼠生后早期（第10天以前）PVN內有較為密集的ER免疫陽性細胞，生后30 d組ER免疫陽性細胞數目最多，而后逐步下降，在SD大鼠發育過程中，ER表達在出生后于PVN內呈先增多后減少的趨勢（表1，圖2）。生后各年齡階段大鼠下丘腦PVN內ER和NOS均有共存表達（表1），且NOS的變化趨勢與ER的變化趨勢基本一致（圖2），提示NO可能是雌激素與雌激素受體結合后所產生的第二信使，并幫助完成雌激素的促神經分化等作用，雌激素水平提高可能有助于NO水平升高，并幫助下丘腦發揮其神經內分泌功能，二者之間的作用機制尚待進一步研究探討。

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Expression variation of estrogen receptor and nitric oxide synthase in the paraventricular nucleus with rat development

ZHAO Chen1WANG Ruifeng2ZHAO Yunhe3YANG Guijiao3
1.Technology Squadron, Criminal Investigation Brigade, Xiaodian Branch, Taiyuan Public Security Bureau, Taiyuan 030032, China; 2.Medical School of Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710061, China; 3.Department of Anatomy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

[Abstract]Objective To observe the quantity and distribution of ER and NOS co-positive cells in hypothalamus with rat development, to explore the expression regulation of nitric oxide and estrogen in postnatal SD rats. Methods SD rats were divided into 5 groups according to the postnatal days 10, 20, 30, 60 and 90, n=5 for each group. The coronal sections in hypothalamus were collected to detect the shape, size and numbers of NOS/ER positive neurons in paraventricular nucleus using the immunohistochemical staining combined with NADPH-d histochemical. Results On the postnatal 10 days rats, NOS/ER double-labeled neurons were greatly detected in the medial parvicellular（31.85±2.01％）, but in the lateral hypothalamic area they were scatted. With the development, the number of double-labeled neurons increased and neurites prolonged. On the postnatal 20 days rats, the proportion of NOS and ER double-positive neurons were（35.16±1.99）％, On the postnatal 30 days rats, it was（43.83±3.13）％, and it was（60.11±2.27）％on the postnatal 60 days rats, On the postnatal 90 days rats, the proportion of NOS and ER double-positive neurons got to（82.78±2.14）％ （F=79.755，P＜0.05）. Conclusion①NOS and ER are co-expression in the hypothalamic paraventricular nucleus during each development stage in the postnatal SD rats.②In paraventricular nucleus, estrogen secretion may promote the NOS expression.

[Key words]Nitric oxide synthase; Estrogen receptor; Paraventricular nucleus; Development

收稿日期：（2015-09-15）

通訊作者▲

[中圖分類號]R339.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-9701（2016）02-0023-04