禽流感病毒分子生物學診斷方法研究進展

李天芝，于新友，苗立中 ，沈志強

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600)

禽流感病毒分子生物學診斷方法研究進展

李天芝1，于新友，苗立中2，沈志強2

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600)

禽流感是流感病毒引起的一種禽類傳染病，同時也是一種人和動物之間的高度傳染性疾病。本文綜述了禽流感病毒分子生物學診斷方法研究進展，主要包括常規RT-PCR、套式RT-PCR、多重RT-PCR、熒光定量RT-PCR、環介導等溫擴增等5種方法，對禽流感防控有一定的參考價值。

禽流感病毒；分子生物學；診斷

禽流感(Avian influenza，AI)是由正黏病毒科流感病毒屬禽流感病毒 (Avian influenza virus，AIV)引起的禽類一種急性、高度接觸性傳染病。主要侵害禽類的呼吸系統、神經系統及消化系統等。根據AIV致病力不同可分為高致病性病毒(HPAI)、低致病性病毒(PAI)和無致病性禽流感病毒。高致病性病毒可導致禽類大批死亡，并嚴重威脅著人類公共衛生安全，低致病性病毒低毒力株能明顯降低家禽的生產性能，并在禽類間隱性傳播，經抗原漂移或抗原轉變形成新毒株或毒力增強。AIV是有包膜的RNA病毒，形態不規整，外觀形態為直徑80~120nm的球狀或長達數千納米的絲狀，其基因組由8條單股負鏈RNA組成，共編碼10種蛋白質。AIV根據糖蛋白血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的不同分為16個HA亞型和10個NA亞型[1]，理論上可形成160種不同的禽流感病毒亞型，且不同亞型的病毒基因組會發生片段重組，造成病毒變異。世界動物衛生組織(OIE)將高致病性禽流感列為法定報告的動物疫病，我國農業部將其列為一類動物疫病。該病不但嚴重危害家禽健康，也可感染人，具有重要的公共衛生意義。分子生物學檢測方法以檢測快度、靈敏度高、特異性好等特點已經廣泛應用于細菌和病毒病的檢測，并展示良好的應用前景。筆者就目前AIV分子生物學檢測方法的研究進展進行綜述，為AIV的防控提供參考。

1 常規RT-PCR方法

PCR方法是根據目的片段設計引物，借助儀器和DNA聚合酶體外大量擴增部分或全部目的片段，是一種快速、簡便、特異的診斷方法。譚丹等[2]建立一種用于擴增H6亞型AIV HA基因的一步法RT-PCR檢測方法，擴增片段為327bp。采用該方法對H6亞型AIV的尿囊液10倍倍比稀釋樣品進行檢測，結果顯示最低檢出量為102.5EID50/ml。用該方法檢測其他亞型AIV和雞新城疫病毒(NDV）等病原均為陰性，具有良好的特異性。王云鶴等[3]建立了一步法檢測H7N9亞型AIV RT-PCR方法，并采取雙盲試驗用熒光定量RT-PCR對該方法進行了比對驗證。結果顯示，用H7亞型特異性引物檢測H1-H15亞型AIV和NDV等其他禽病病原，除H7亞型流感病毒外，其他樣品均為陰性，用N9亞型特異性引物檢測N1-N9亞型AIV和其他禽病病原，僅當前流行的H7N9亞型AIV樣品有特異性目的條帶，與其他N1-N9亞型AIV和雞新城疫病毒(NDV)等其他禽病病原均無交叉反應。通過對H7N9亞型AIV尿囊液進行10倍倍比稀釋檢測，證實該方法最低檢出量為1.4×102.5EID50.ml-1。喬明明等[4]根據GenBank中收錄的AIV N9亞型高度保守的基因序列設計引物，通過優化反應條件建立AIV N9亞型RT-PCR檢測方法，并對該方法進行靈敏度、敏感性、特異性試驗和臨床樣品檢測。建立了AIVN9亞型RT-PCR檢測方法，用該方法檢測時，H7N9、H10N9均呈陽性，而非 N9亞型的 AIV及NDV等其他禽傳染病病毒均呈陰性，能檢測到1/32血凝單位的H7N9AIV。羅思思等[5]根據GenBank中H6亞型 AIV的HA基因、N1亞型 AIV的NA基因和所有亞型AIV的M基因序列，分別設計并篩選出3對特異性引物，優化引物之間的濃度，建立了H6N1亞型AIV三重RT-PCR檢測方法。結果顯示，所建立的方法對H6N1亞型AIV可特異性擴增出447(H6亞型AIV)、325(N1亞型 AIV)和 669bp(AIV)目的條帶，對 H6亞型 AIV擴增出447bp、669bp目的條帶，對 N1亞型 AIV擴增出325bp、669bp目的條帶，對其他亞型AIV僅擴增出669bp目的條帶，對常見禽病病原體均未擴增出任何條帶，該法對H6N1亞型AIV檢測下限為0.1pg。

2 套式RT-PCR方法

套式PCR方法是設計內外2種引物，同時擴增2次，該法能節省模板，且敏感性較高。郭捷等[6]針對H1亞型AIV血凝素(HA)基因保守區，設計合成了2對特異性引物，并優化反應條件進行巢式PCR反應，結果顯示，該PCR方法能特異性檢測到H1亞型AIV，其敏感性最低能檢測到13.2fg/μl的H1亞型AIV RNA模板。本研究建立的巢式PCR方法為H1亞型AIV的早期診斷及有效防制提供了快速、特異且敏感的檢測方法。劉婷婷等[7]針對H3亞型AIV HA基因保守序列，設計并篩選出2對特異性引物，建立了H3亞型AIV巢式PCR檢測方法，特異性試驗結果表明該法只能檢測到H3亞型AIV，對其他常見禽病病原體不擴增，敏感性試驗結果表明該巢式PCR對H3亞型AIV檢測下限為 1×103拷貝/μl，靈敏度比常規PCR高100倍。吳嬡瓊等[8]針對H4亞型AIV HA基因保守序列，設計并篩選出2對特異性引物，通過優化反應條件，建立了H4亞型AIV套式RT-PCR檢測方法。特異性試驗結果顯示，該法可特異性檢測出H4亞型AIV，對其他常見禽病病原體無交叉，敏感性試驗結果顯示，該法對H4亞型AIV檢測下限為360fg/μl，用該法對106份臨床樣品進行檢測，臨床樣品檢測結果與病毒分離結果一致。

3 多重RT-PCR方法

多重PCR是在常規PCR基礎上發展起來的，在同一PCR體系中，加入多對引物，同時檢測2種或多種病原核酸，它具有快速、靈敏度高、特異性強等優點廣泛用于各種臨床疾病的快速診斷。郝明飛等[9]根據GenBank中已登錄的鴨病毒性肝炎病毒(DHV)、AIV和NDV的基因序列，設計了3對特異性引物，建立了DHV、AIV和NDV的多重PCR鑒別診斷技術，并對體系進行了優化和特異性、敏感性試驗。結果表明，該體系所擴增的3種病毒基因片段大小分別為 174bp(DHV)、264bp(AIV)和 362bp(NDV)，且特異性、敏感性良好，能夠分別檢出1pg AIV、10pg DHV和10pg NDV的病毒RNA。郭捷等[10]據H1亞型、H3亞型AIV HA基因和M基因的核苷酸序列，分別設計3對特異性引物，以含有H1亞型AIV和H3亞型AIV的cDNA為模板，對三重PCR擴增條件進行優化，驗證其特異性和敏感性，并對臨床樣品進行AIV檢測。結果顯示，H1和H3亞型AIV混合模板經三重PCR擴增可獲得3條特異性條帶，其中302bp為H1亞型 HA基因、453bp為 M基因、626bp為 H3亞型HA基因，含有H1或H3亞型AIV的模板均出現兩條特異性條帶，大小分別為302bp和453bp、453 bp和626bp，含有其他亞型AIV的模板僅出現一條特異性條帶(453bp)，而其他禽呼吸道疾病病毒均未擴增出任何條帶。優化后的三重PCR最低能同時檢測出7.00pg的H1亞型AIV、3.62pg的M基因和20.60pg的H3亞型AIV，對100個臨床樣品進行AIV檢測，AIV總陽性率為36%，其中H1亞型陽性率4%、H3亞型陽性率9%、其他亞型陽性率23%。袁萬哲等[11]根據GenBank登錄的AIV M1基因與NDV M基因核苷酸序列，設計用于擴增AIV與NDV的RT-PCR引物，建立了AIV與NDV二重RT-PCR檢測方法。敏感性和特異性試驗結果表明，該方法對AIV與NDV的最低核酸檢出量分別為38和27pg，可同時擴增出428bp(AIV)與297bp(NDV)的特異性片段，而對傳染性法氏囊病毒(IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)與DHV的檢測結果均為陰性。李海琴等[12]根據GenBank發表的 H5、H9亞型AIV HA基因和鴨坦布蘇病毒(DTMUV)的NS5基因序列，分別設計了3對特異性引物，通過優化擴增條件，建立了同時檢測H5亞型AIV、H9亞型 AIV和 DTMUV的多重PCR檢測方法，對其特異性及敏感性進行檢驗，并在臨床中進行初步應用。結果表明，該多重PCR方法具有良好的特異性和敏感性，可同時擴增出大小分別為 732bp(H9亞型 AIV)、380bp(H5亞型 AIV)、250bp(DTMUV)的特異片段，利用本試驗建立的多重PCR對其他鴨病病原體進行擴增結果均為陰性，利用這3對引物對H5、H9亞型AIV和DTMUV進行敏感性檢測，結果顯示最低檢測極限分別為533pg·μl-1、56pg·μl-1和 6.6ng·μl-1。趙虹等[13]針對Gen Bank中DTMUV NS2基因、所有亞型AIV的M基因和H9亞型AIV的HA基因的保守序列，分別設計了3對特異性引物，建立了DTMUV和AIV多重PCR檢測方法。該方法對混有H9亞型AIV和DTMUV的模板進行PCR擴增，得到了3個大小與試驗設計相符的特異性擴增條帶，對其他鴨病病原體進行PCR擴增，結果均為陰性。敏感性測定結果表明，該方法能檢測到45pg的DTMUV、7.6pg的H9亞型AIV和76pg的M基因。屈素潔等[14]根據 GenBank中 H5、H7和 H9亞型 AIV 的 HA 基因序列的保守區域，利用Primer 5.0軟件設計3對分別針對AIV H5、H7和H9亞型的特異性引物，預期特異擴增H5AIV片段大小為380bp、H7AIV為501bp、H9AIV為732bp。經過反應條件的優化，建立了同時檢測H5、H7和 H9亞型 AIV的一步法多重RT-PCR方法。該方法特異性強，對其他亞型AIV和禽呼吸道病原體檢測結果為陰性，敏感性高，H5、H7和H9亞型AIV RNA的最低檢出量分別為 10-4、10-4、10-2拷貝/μl。

4 熒光定量RT-PCR方法

熒光定量PCR技術是指采用熒光探針或SYBR GreenⅠ熒光染料通過連續監測熒光信號強弱的變化來測定特異性產物的量，不需要分離PCR產物，即能準確定量起始模板數。且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等優點。曹軍平等[15]根據H5亞型AIV HA基因上的保守序列，設計合成引物，以H5亞型AIV HA基因重組質粒為標準品繪制標準曲線，建立了熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應檢測方法。結果表明，本試驗建立的標準曲線循環閾值 (Ct值)與模板濃度具有良好的線性關系，相關系數為 0.995，靈敏度約為 8拷貝/μl，相當于 8個AIV顆粒，對NDV和其他禽病病毒無交叉反應，特異性好、重復性佳。徐守振等[16]通過RT-PCR擴增H9亞型AIV的HA基因保守片段，將其克隆到pMD18-T載體，經測序驗證正確作為陽性質粒。以陽性質粒為標準品，建立SYBR Green I熒光定量RT-PCR的標準曲線。結果表明，該方法靈敏性可達74.3copies/μl，且特異性好、重復性佳。郭捷等[17]根據對GenBank中H1亞型AIV HA基因序列的分析，設計針對H1亞型AIV的HA基因特異性引物，并以H1亞型AIV的cDNA為模版，構建重組陽性質粒。采用梯度稀釋重組標準品陽性質粒DNA的方法，建立SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR標準曲線。敏感性試驗結果顯示，擴增效率和標準誤差分別為100.9%和0.0117，熔解曲線呈單一熔解峰。在35個Ct值內該方法可檢測到100個拷貝的標準品DNA，特異性試驗結果顯示，該方法對于其他亞型AIV和禽呼吸道病原體不能檢出，重復性試驗結果顯示，組內變異系數小于1%。劉婷婷等[18]根據H3和N8亞型AIV的HA和NA基因保守序列，設計合成了2對特異性引物和2條Taq Man探針，通過優化反應條件建立了H3N8亞型AIV一步法實時熒光定量RT-PCR。結果表明：該方法敏感型好，對H3N8亞型AIV檢測敏感性達100個模板拷貝數。該方法特異性強，僅對H3和N8亞型AIV檢測為陽性，應用該方法對96份臨床樣品進行檢測，結果與病毒分離鑒定結果一致。周其偉等[19]針對H7N9AIV的HA和NA基因分別設計特異性引物和Taq Man-LNA探針，建立H7N9AIV特異性實時熒光RT-PCR快速檢測方法。結果顯示，該法對檢測H7N9AIV株的靈敏度達到10PFU/ml。該方法特異性強，與其他亞型流感病毒株及呼吸道病原體無交叉反應。與對照方法相比，本研究方法的檢測陽性符合率為99.07%，陰性符合率為100%，Kappa值為0.993。劉婷婷等[20]根據H3和H4亞型AIV HA基因的保守序列，分別設計合成特異性引物和用不同熒光基團標記的Taq Man探針。通過優化反應條件建立了H3和H4亞型AIV雙重實時熒光定量RTPCR檢測方法。結果顯示，該法特異性好，敏感性達1000拷貝/μl，組內重復與組間重復性的平均變異系數均小于3%，應用該法對96份臨床樣品檢測，結果與病毒分離鑒定結果一致。羅思思等[21]根據 GenBank中 H6、N1亞型 AIV的 HA、NA基因序列，設計2對特異性引物和2條用不同熒光基團標記的TaqMan探針。經反應條件優化，本試驗建立了檢測H6N1亞型AIV的二重熒光RT-PCR方法。該法特異性強，只對H6亞型和N1亞型AIV進行特異性擴增，對其他H亞型AIV、N亞型AIV及NDV、IBV等病原體的檢測均為陰性，該法敏感性好，對H6N1亞型AIV的檢測限為100拷貝/μl。

5 環介導等溫擴增技術

環介導恒溫擴增檢測方法是一種新興的分子生物學檢測方法，已廣泛應用于多種細菌病和病毒病的檢測，以操作簡單、檢測速度快、敏感性好、特異性高等優勢適合基層部門應用。蔣菲等[22]建立了H9亞型AIV的反轉錄環介導等溫核酸擴增技術(RT-LAMP)，檢測方法，該方法使用了對應于H9亞型AIV HA基因的8個不同區域的6條特異引物，在63℃的等溫條件下反應，最低可檢測到103拷貝的目的基因重組質粒片段，較RT-PCR方法敏感10倍。通過對15種H亞型AIV、NDV、IBV的檢測表明，該方法具有良好的特異性。在反應體系中使用鈣黃綠素與Mn2+的混合溶液作為熒光指示劑可以用于RT-LAMP結果判定，并且其判斷結果與濁度判斷結果一致。對109份禽咽喉拭子及泄殖腔拭子臨床樣品進行檢測，RT-LAMP與RTPCR檢出陽性樣本數分別為61份和46份，表明RT-LAMP方法陽性檢出率高于RT-PCR。彭宜等[23]根據GenBank中AIV M基因序列，設計針對所有亞型AIV的通用檢測引物，并對反應條件進行優化，建立了檢測AIV的RT-LAMP可視化檢測方法。結果表明，建立的檢測方法對AIV總RNA最小檢出限為10fg，靈敏度為RT-PCR的1 000倍，能特異地檢測出所有不同的HA亞型AIV，對其他禽呼吸道病原體無擴增反應，該法快速，在常規水浴鍋或金屬恒溫槽中50min就可完成，反應結束后不需開蓋即可直接用肉眼根據反應液的顏色變化對結果進行判定。但曉雅等[24]利用改良RT-LAMP技術建立一種快速、靈敏的檢測方法用于H9亞型AIV檢測。該法根據H9亞型AIV血凝素(HA)基因保守區序列中的8個區段設計6條特異性引物，在恒溫條件下進行核酸擴增反應，并以瓊脂糖凝膠電泳和目視檢查綠色熒光兩種方法對擴增結果進行判定。結果表明，RT-LAMP的最小檢測限為100fg，靈敏度比PT-PCR高100倍，且與H5亞型、H7亞型AIV，NDV無交叉反應。目視檢查綠色熒光與常規瓊脂糖凝膠電泳的判定結果一致。整個擴增檢測過程在35min內即可完成。利用臨床樣本對RT-LAMP法進行驗證，結果與RTPCR一致。由實時濁度分析得到的標準曲線，計算出臨床樣本中的病毒質粒拷貝數均在2×107~2×104之間。包紅梅等[25]根據GenBank中登錄的H7亞型AIV HA基因序列，設計引物，建立了一種基于RT-LAMP技術的H7亞型AIV診斷方法。結果顯示，該方法對H7AIV RNA的最小檢測限為0.1pg，靈敏度高于普通一步法RT-PCR 100倍，全部反應可在1.5h內完成，在反應體系中添加Fluorescent Detection Reagent染料后，可通過肉眼觀察有無熒光直接判定結果。靈敏性及特異性試驗證明，該方法靈敏度高、特異性好，能夠作為H7亞型AIV的快速診斷方法。石霖等[26]針對AIV M基因設計了4個不同區段的特異性引物，并對反應條件和反應體系進行優化，建立了AIV的RTLAMP方法。結果表明，該方法對AIV H1~H16亞型的檢測結果均為陽性，而對其他禽類病毒的擴增均為陰性，具有良好的特異性。對AIV的最低檢測限為13.43EID50/ml，靈敏度為普通一步RT-PCR的10倍，擴增反應可以在恒溫水浴內60min內完成，在反應體系中添加熒光染料后，肉眼即可判定檢測結果。該檢測方法與RT-PCR方法和熒光定量RT-PCR方法對臨床樣品檢測的符合率均為81.8%。陳兵等[27]將AIV、NDV和IBDV三種病毒性疾病作為一個檢測整體，建立了對三種疫病同時進行篩選檢測的多重RT-LAMP檢測方法，建立了AIV、NDV和IBDV三種病毒實時熒光多重 RTLAMP檢測方法，結果顯示：該法可對AIV、NDV和IBDV同時進行篩選檢測，靈敏度可達到10個基因拷貝，與單重LAMP檢測的靈敏度相當，所建立的方法特異性強，與其他病原體無交叉反應。

6 小結與展望

隨著分子生物學的發展，各國專家、學者先后建立了多種AIV分子生物學檢測方法，

但這些方法各有優缺點，如常規PCR方法、套式PCR方法和多重PCR方法，雖然檢測簡單、快速、方便但不能精確定量，且敏感性有限，容易漏檢。熒光定量PCR技術彌補了常規PCR方法的缺點，但由于所用儀器和試劑價格昂貴，成本高，且對操作人員有很高的要求，不利于其在基層獸醫部門大規模推廣應用。LAMP方法是一種新興的方法，不需要特殊的儀器設備，操作簡便，但敏感性太高，易導致假陽性結果，且單獨使用任何一種方法都很難正確診斷該病，做好將各種方法結合起來，綜合判斷，不同單位可根據自身的情況選擇適合的方法，

相信隨著分子生物學的不斷發展，將會有更多的新型分子生物學診斷方法建立，從而為鴨病毒性肝炎的診斷、分子流行病學調查和防控提供保障。

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