pEGFP-prohibitin真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在人肝癌細(xì)胞系Hep G2中的表達(dá)

翟嵩 孫明珠 王文俊 李亞萍 張欣 李梅黨 雙鎖

?

pEGFP-prohibitin真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在人肝癌細(xì)胞系Hep G2中的表達(dá)

翟嵩 孫明珠 王文俊 李亞萍 張欣 李梅黨 雙鎖

【摘要】目的 構(gòu)建pEGFP-prohibitin真核表達(dá)質(zhì)粒，并鑒定其在pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞系Hep G2中的表達(dá)。方法 采用高保真PCR擴(kuò)增獲得prohibitin的全長(zhǎng)編碼序列，構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-prohibitin，并通過(guò)基因測(cè)序和BLAST比對(duì)鑒定重組質(zhì)粒；提取pEGFP-prohibitin和pEGFP-N1質(zhì)粒，并通過(guò)TurboFect轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞；采用實(shí)時(shí)PCR和Western印跡方法分別在MRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)prohibitin蛋白在轉(zhuǎn)染后Hep G2細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果 成功構(gòu)建pEGFP-prohibitin真核表達(dá)重組質(zhì)粒，并將其成功轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞；pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞prohibitin的表達(dá)量比空載轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞明顯增加。結(jié)論 成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-prohibitin，并證明抗增殖蛋白prohibitin在pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系Hep G2中高表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】prohibitin蛋白；基因表達(dá)；重組質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染

抗增殖蛋白prohibitin屬于細(xì)胞膜蛋白超家族，是一種正常人體細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的多功能蛋白［1］，在物種間高度保守［2］。prohibitin為線粒體分子伴侶蛋白，有利于維持線粒體的形態(tài)和功能，異常表達(dá)可引起線粒體損傷，從而可能啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)源性凋亡［3］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，prohibitin與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，尤其是在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［4］。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，prohibitin在 HCB體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)表達(dá)上調(diào)［5］。通過(guò)對(duì)其功能的研究將有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)肝臟疾病的發(fā)生機(jī)制，從而為臨床治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。但到目前為止，prohibitin高表達(dá)對(duì)于HCV所導(dǎo)致的肝細(xì)胞凋亡中所發(fā)揮的生物學(xué)影響及其具體作用機(jī)制尚不清楚，本研究為了進(jìn)一步探討prohibitin高表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)，構(gòu)建了真核表達(dá)重組系統(tǒng)，并對(duì)pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系Hep G2中高表達(dá)進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步的生物學(xué)功能研究提供依據(jù)。

材料和方法

一、材料

人肝癌細(xì)胞系Hep G2由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室保存。真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1購(gòu)自美國(guó)BDBiosciences Clontech公司；Top 10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；限制性?xún)?nèi)切酶HindIII、限制性?xún)?nèi)切酶KpnI、DNA連接試劑盒、反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA合成試劑盒、SYBR○RPremix Ex TaqTMII、電泳用瓊脂糖均購(gòu)自日本Ta KaRa公司；高保真PCR試劑盒、TurboFect Transfection Reagent購(gòu)自美國(guó)Therm o公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔Ig G抗體、兔抗人prohibitin多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞系Hep G2細(xì)胞使用含10％胎牛血清的DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，嚴(yán)格無(wú)菌操作，每天換液1次。電子顯微鏡下觀察細(xì)胞密度達(dá)到80％以上時(shí)即可進(jìn)行細(xì)胞傳代，嚴(yán)格按照細(xì)胞培養(yǎng)傳代方法，2～3 d按1∶1比例傳代1次。

三、細(xì)胞總RNA提取

第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄合成及prohibitin基因全長(zhǎng)編碼序列擴(kuò)增具體實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)［6］；按照瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行目的DNA片段的純化和回收。回收的DNA片段，紫外分光光度儀測(cè)定濃度后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

四、pEGFP-prohibitin真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

選取含有CMV啟動(dòng)子的pEGFP-N1質(zhì)粒載體及其多克隆位點(diǎn)，根據(jù)Omega去內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒說(shuō)明進(jìn)行pEGFP-N1質(zhì)粒抽提，抽提好的質(zhì)粒-20℃保存?zhèn)溆谩?yīng)用限制性?xún)?nèi)切酶HindIII和KpnI分別消化純化回收的目的基因片段，應(yīng)用限制性?xún)?nèi)切酶HindIII和KpnI消化pEGFP-N1質(zhì)粒；根據(jù)DNA連接試劑盒說(shuō)明，將雙酶切后的pEGFP-N1與prohibitin片段連接，使之成為重組質(zhì)粒pEGFP-prohibitin。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的菌液涂布于具有卡那霉素抗性的LB平板培養(yǎng)基，37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)。經(jīng)卡那霉素抗性篩選出陽(yáng)性菌落，挑取5個(gè)菌落分別接種于卡那霉素陽(yáng)性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩過(guò)夜，提取質(zhì)粒，方法同前。

五、PCR鑒定重組質(zhì)粒pEGFP-prohibitin

將重組質(zhì)粒pEGFP-prohibitin進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察能否擴(kuò)增得到約819 bp的目的DNA，以此鑒定prohibitin基因片段是否插入pEGFP-N1載體，是否與pEGFP-N1載體成功連接。將PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆送北京天根生化科技有限公司測(cè)序，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)在線軟件BLAST將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列一致性比對(duì)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［7-9］。

六、實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)prohibitin MRNA

使用SYBR○RPremix Ex TaqTMII試劑在Bio-Rad iQ5實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行。引物由Ta KaRa公司合成（PAGE級(jí)），prohibitin：上游5′-AAACAGGTGGCTCAGCAGGAA-3′，下游5′-CAGTGAGTTGGCAATCAGCTCAG-3′。GAPDH：上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游5′-TGGTGAAGACGCAGTGGA-3′。反應(yīng)體系25μL：2×SYBR○R

Premix 12.5μL，上下游引物各1μL，模板cDNA1μL，dd H2O9.5μL。反應(yīng)條件：95℃5 s；95℃30 s，60℃30 s，72℃10 s，50個(gè)循環(huán)；72℃10 s。結(jié)果由Bio-Rad iQ5軟件分析，通過(guò)2-△△Ct計(jì)算抗增殖蛋白基因的相對(duì)差異表達(dá)倍數(shù)。

七、Western印跡檢測(cè)prohibitin蛋白的表達(dá)

棄去轉(zhuǎn)染pEGFP-prohibitin、pEGFP-N1空載質(zhì)粒48 h后及對(duì)照未轉(zhuǎn)染空白細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS洗兩遍，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，收集細(xì)胞到EP管中。4℃12 000 r/min離心15 min，收集上清液。按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，Western印跡檢測(cè)prohibitin，一抗為兔抗人prohibitin多克隆抗體（1∶1 000稀釋?zhuān)篂镠RP標(biāo)記的羊抗兔Ig G（1∶200）。ECL顯色，曝光X線片。GAPDH的檢測(cè)：一抗為兔抗人GAPDH多克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔Ig G（1∶200）。使用Syngene凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)Western印跡圖像進(jìn)行分析，得到條帶的灰度值。將各組細(xì)胞prohibitin與內(nèi)參GAPDH表達(dá)水平灰度值比進(jìn)行比較［5，6］。

八、統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)多組均數(shù)比較利用單因素方差分析ANOVA，兩組比較使用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　果

一、pEGFP-prohibitin質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

（一）prohibitin全長(zhǎng)CDS的擴(kuò)增 如圖1所示，經(jīng)高保真PCR得到約819 bp的prohibitin基因片段，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1　prohibitin高保真PCR產(chǎn)物和雙酶切pEGFP-N1產(chǎn)物電泳圖

（二）pEGFP-prohibitin重組質(zhì)粒的構(gòu)建HindIII和KpnI雙酶切pEGFP-N1質(zhì)粒，獲得一條約4.7 kb的線性質(zhì)粒條帶，此結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相一致。圖2顯示質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果，以pEGFP-prohibitin為模板擴(kuò)增prohibitin，得到約819 bp的片段，結(jié)果與預(yù)期一致。經(jīng)BLAST比對(duì)分析pEGFP-prohibitin測(cè)序結(jié)果顯示與prohibitin（NM_002634.2）完全相同，插入片段為prohibitin基因，插入方向正確，讀碼框無(wú)移位。

圖2　質(zhì)粒PCR電泳圖

（三）pEGFP-prohibitin和pEGFP-N1質(zhì)粒的中量提取 使用Omega去內(nèi)毒素質(zhì)粒中量提取試劑盒抽提pEGFP-prohibitin和pEGFP-N1質(zhì)粒。經(jīng)紫外分光光度儀檢測(cè)，pEGFP-prohibitin質(zhì)粒濃度為125.6μg/ML，A260/A280比值是1.95。pEGFP-N1質(zhì)粒濃度是199.6μg/ML，A260/A280比值是1.97。說(shuō)明抽提的質(zhì)粒質(zhì)量比較好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

二、prohibitin蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中高表達(dá)的鑒定

（一）倒置熒光顯微鏡觀察 轉(zhuǎn)染24 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察，pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組和pEGFP-N1空載轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中都可以觀察到明亮的綠色熒光，但是未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組沒(méi)有觀察到明亮的綠色熒光（圖3）。而且熒光的強(qiáng)度在轉(zhuǎn)染后24 h可達(dá)到最強(qiáng)度，此后隨著時(shí)間的推移緩慢地減弱。

圖3　轉(zhuǎn)染后24 h三組細(xì)胞熒光顯微鏡及對(duì)應(yīng)的光鏡觀察結(jié)果（HE，×40）

（二）實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)prohibitin MRNA在三組細(xì)胞中的表達(dá) prohibitin MRNA的相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct值表示。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞prohibitin MRNA表達(dá)量是未轉(zhuǎn)染組的5.715倍、空載轉(zhuǎn)染組的2.460倍。用單因素方差分析及兩兩比較對(duì)三組細(xì)胞prohibitin MRNA表達(dá)量進(jìn)行分析，pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組prohibitin MRNA表達(dá)量明顯高于另外兩組（P＜0.05），這說(shuō)明通過(guò)轉(zhuǎn)染pEGFP-prohibitin真核表達(dá)重組質(zhì)粒，prohibitin MRNA發(fā)生了表達(dá)上調(diào)。但是空載轉(zhuǎn)染對(duì)照組以及未轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞prohibitin MRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

三、Western印跡檢測(cè)三組細(xì)胞內(nèi)prohibitin蛋白表達(dá)差異情況

使用Western印跡方法檢測(cè)48 h后轉(zhuǎn)染組、空載轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對(duì)照組三組細(xì)胞中的prohibitin表達(dá)情況（圖4）。細(xì)胞中prohibitin與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度，兩者灰度值的比值反映了prohibitin蛋白的表達(dá)變化情況。灰度分析顯示，pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞prohibitin/GAPDH灰度值比是0.952±0. 080，pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞prohibitin/GAPDH灰度值比是0.429±0.070，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞prohibitin/ GAPDH灰度值比是0.309±0.045。pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞prohibitin/GAPDH灰度值比分別是空載轉(zhuǎn)染組的2.219倍和未轉(zhuǎn)染組的3.081倍。三組細(xì)胞中的prohibitin蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），轉(zhuǎn)染組明顯高于空載轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組，但是空載轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組之間不具有顯著性差異。上面實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將pEGFP-prohibitin真核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入Hep G2細(xì)胞中后，與對(duì)照組細(xì)胞相較，prohibitin發(fā)生了表達(dá)上調(diào)。

圖4　Western印跡檢測(cè)三組細(xì)胞內(nèi)prohibitin蛋白表達(dá)情況

討　論

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用使一系列新蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)是機(jī)體生物功能的主要承擔(dān)者，任何疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中表達(dá)異常的蛋白一定與致病機(jī)制存在著某種聯(lián)系。因此，尋找表達(dá)異常的蛋白并研究其功能是探索致病機(jī)制的可行思路［10］。目前丙型肝炎的檢出率逐年升高，而尚無(wú)有效疫苗能夠預(yù)防HCV傳播，現(xiàn)行的丙型肝炎的治療方法仍然具有一定的局限，因此對(duì)其致病機(jī)制的研究及探尋新的治療藥物或方法是目前亟待解決的問(wèn)題，加強(qiáng)對(duì)HCV感染后機(jī)體異常表達(dá)蛋白的研究則是揭示HCV感染與肝細(xì)胞相互之間作用機(jī)制的重要途徑［11-13］。運(yùn)用蛋白組學(xué)方法篩選HCV感染中表達(dá)異常的蛋白則是循此思路探索HCV致病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)［14-16］。

prohibitin是一種高度保守的蛋白質(zhì)，廣泛分布于細(xì)菌、酵母、原蟲(chóng)、植物和哺乳動(dòng)物等真核生物細(xì)胞中，具有高度的同源性［2］。人prohibitin基因位于染色體17q21，相對(duì)分子質(zhì)量為32×103的prohibitin蛋白［17］。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)prohibitin在許多腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，因此推測(cè)prohibitin可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系［6］，但是prohibitin高表達(dá)在肝臟疾病發(fā)病機(jī)制方面所發(fā)揮的作用尚不清楚［18］。

為了進(jìn)一步闡明prohibitin的功能，詮釋prohibitin表達(dá)上調(diào)在肝細(xì)胞損傷中所發(fā)揮的作用，本研究運(yùn)用高保真PCR擴(kuò)增獲得prohibitin的全長(zhǎng)編碼序列，并將其插入pEGFP-N1質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建出讀碼框無(wú)移位和序列正確的真核表達(dá)載體pEGFP-prohibitin。使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒提取pEGFP-prohibitin和pEGFP-N1質(zhì)粒，通過(guò)TurboFect轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞，通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)摸索優(yōu)化條件，得到最佳轉(zhuǎn)染效率。進(jìn)一步利用倒置熒光顯微鏡觀察prohibitin在Hep G2細(xì)胞中的表達(dá)，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR和Western印跡分別在MRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)prohibitin蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pEGFP-prohibitin真核表達(dá)重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞，pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞prohibitin的表達(dá)量比空載轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞發(fā)生了明顯增加，prohibitin在轉(zhuǎn)染的Hep G2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，為進(jìn)一步研究prohibitin高表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)提供了基礎(chǔ)，為了解肝臟疾病發(fā)病機(jī)制和基因治療HCV感染提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)資料和依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

1 彭琳，黃裔騰，許鎰洧，等. Prohibitin與乳腺癌.癌變·畸變·突變，2012，1：75-77.

2 Tsutsu mi T，Matsuda M，Aizaki H，et al. Proteo mics analysis of mitochondrial proteins reveals overexpression of a mitochondrial protein chaperon，PHB，in cells expressing hepatitis Cvirus core protein. Hepatology，2009，50：378-386.

3 Rizwani W，Alexandrow M，Chellappan S. Prohibitin physically interacts with MCMproteins and inhibits ma Mmalian DNAreplication. Cell Cycle，2009，8：1621-1629.

4 McClung JK，Danner DB，Stewart DA，et al.Isolation of a cDNAthat hybrid selects antiproliferative MRNAfro Mratliver. Biochem Biophys Res comMun，1989，164：1316-1322.

5 Dang SS，Sun MZ，Yang E，et al. Prohibitin is overexpressed in Huh-7-HCVand Huh-7. 5-HCVcells harboring in vitro transcribed full-length hepatitis Cvirus RNA. Virol J，2011，8：424.

6 黨雙鎖，孫明珠，尋萌，等.抑制素在人肝癌細(xì)胞SMMC-7721和Huh-7中的表達(dá)及其編碼序列擴(kuò)增.中國(guó)肝臟病雜志，2010，2：1-5.

7 徐濤，彭云云，李琳，等.pEGFP-C2 -NLRC5重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達(dá).安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49：5-8.

8 郭靜雅，陳昌友，王志強(qiáng)，等.人CXCR3 B基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建、鑒定及生物學(xué)功能研究.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27：1288-1294.

9 任麗偉，丁愛(ài)軍，徐貴江，等.提高基因轉(zhuǎn)染效率方法的研究.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，5：82-84.

10 Dia Mond DL，Proll SC，Jacobs JM，et al. HepatoProteo mics：applying proteo mic technologies to the study of liver function and disease. Hepatology，2006，44：299-308.

11 Bigger CB，Guerra B，Brasky KM，et al. Intrahepatic gene expression during chronic hepatitis Cvirus infection in chim panzees.JVirol，2004，78：13779-13792.

12 趙四海，尋萌，楚雍烈，等.丙型肝炎病毒全基因組培養(yǎng)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因的差異表達(dá).浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，37：164-169.

13 Gao X，Zheng J，Beretta L，et al. The 2009 hu man liver proteo me project（HLPP）workshop. Proteo mics，2010，10：3058-3061.

14 張學(xué)群，姜穎，厲有名，等.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在非酒精性脂肪肝研究中的應(yīng)用.中華肝臟病雜志，2006，14：798-800.

15 劉艷麗，閆巖，白文濤，等.HCV核心蛋白在Hep G2細(xì)胞中對(duì)COX-2表達(dá)的影響.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2006，22：343-345.

16 王文勇，張志培，黃立軍，等.丙型肝炎病毒核心蛋白對(duì)突變p53 和Bcl-2表達(dá)的影響及意義.中華肝臟病雜志，2005，13：148-149.

17 Sato T，Saito H，Swensen J，et al. The hu man prohibitin gene located on chro Moso me 17q21 is Mutated in sporadic breaset cancer. Cancer Res，1992，52：1643-1646.

18 孫明珠，黨雙鎖.抗增殖蛋白在肝臟疾病中的研究進(jìn)展.中國(guó)肝臟病雜志，2011，3：61-64.

（本文編輯：錢(qián)燕）

Establish ment and expression of recom binant pEGFP-prohibitin plasmid in HepG2 cell line

ZHAISong，SUNMing-zhu，WANGWen-jun，LIYa-ping，ZHANGXin，LIMei，DANGShuang-suo. Department of infectious diseases，thesecond affiliated hospital of medicalschool of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710004，China

【Abstract】Objective To construct eukaryotic expression plasmid of enhanced green fluorescent protein plasmids （pEGFP）prohibitin，and to observe its expression in transfected Hep G2 cells. Methods The full coding sequence of prohibitin was am plified by high fidelity poly merase chain reaction（PCR）. Mean w hile，the eukaryotic expression vector of pEGFP-prohibitin was constructed and identified by gene sequencing and basic local align ment search tool（BLAST）. Plasmids of pEGFP-prohibitin and pEGFP-N1 were extracted and transfected into Hep G2 cells by TurboFect oligofectamine reagent，expression of w hich in transfected Hep G2 cells was assessed by real time PCRat MRNAlevel and western blot at protein level. Results Recombinant pEGFP-prohibitin plasmid was successfully constructed then transfected into Hep G2 cells，prohibitin expression in w hich was apparently higher than that in Mock-vehicle and non-transfection groups. Conclusion The eukaryotic expression vector of pEGFP-prohibitin was constructed successfully，and prohibitin was confirmed to be up-regulated in Hep G2/pEGFP-prohibitin cells.

【Key words】Prohibitin；Gene expression；Recombinant plasmid；Transfection

收稿日期：（2015-07-07）

Corresponding author：DANGShuang-suo，Email：dang212@126.com

通信作者：黨雙鎖，Email：dang212@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81170393）

作者單位：710004 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院感染科