大七氣湯單用及聯合順鉑對SKOV-3細胞移植瘤Survivin與Caspase-3表達的影響

楊　洋　博　君， 李 舒， 王 爽， 陳 蓉

（1.重慶醫科大學中醫藥學院，重慶400016；2.重慶醫科大學中醫藥研究室，重慶400016）

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大七氣湯單用及聯合順鉑對SKOV-3細胞移植瘤Survivin與Caspase-3表達的影響

楊洋博君1， 李 舒1， 王 爽1， 陳 蓉2*

（1.重慶醫科大學中醫藥學院，重慶400016；2.重慶醫科大學中醫藥研究室，重慶400016）

摘要：目的 探討大七氣湯加減方（姜黃、三棱、莪術、半枝蓮等）單用及聯合順鉑對SKOV-3細胞移植瘤Survivin 與Caspase-3表達的影響。方法 將SKOV-3細胞移植瘤造模成功的40只荷瘤鼠隨機分為模型對照組、大七氣湯低、高劑量組、順鉑組、順鉑聯合大七氣湯組，每組8只，給藥21 d后處死所有荷瘤鼠，稱瘤重，測瘤體積，以逆轉錄-聚合酶鏈反應法和蛋白質印跡法檢測瘤組織Survivin、Caspase-3 mRNA及蛋白的表達。結果 各用藥組瘤重和瘤體積均小于模型對照組（P＜0.01）；逆轉錄-聚合酶鏈反應和蛋白質印跡法檢測結果顯示中藥組Survivin mRNA及蛋白表達明顯低于模型對照組（P＜0.01），且大七氣湯低劑量組與DDP順鉑組比較差異有統計學意義（P＜0.05），且DDP聯合大七氣湯組表達最低；用藥組Caspase-3 mRNA和蛋白表達明顯高于模型對照組（P＜0.01），且大七氣湯低劑量組與順鉑組比較差異有統計學意義（P＜0.05），且順鉑聯合大七氣湯組表達最高。結論 大七氣湯加減方能夠下調Survivin和上調Caspase-3的表達來達到抑制腫瘤細胞生長和促進腫瘤細胞凋亡，且大七氣湯聯合順鉑對SKOV-3細胞移植瘤治療具有增效作用。

關鍵詞：大七氣湯；順鉑；人卵巢癌細胞株SKOV-3；Survivin；Caspase-3

Effects of single Daqiqi Decoction and combined w ith DDP on Survivin and Caspase-3 expressions of SKOV-3 cell transplanted tumor

YANG Yang-bo-jun1， LIShu1， WANG Shuang1， CHEN Rong2*
（1.College of TCM，Chongqing Medical University，Chongqing 4OOO16，China；2.Institute of TCM，Chongqing Medical University，Chongqing 4OOO16，China）

ABSTRACT：AIM To exp1ore the effects of sing1emodified DaqiqiDecoction（Rhizoma curcumae 1ongae，Sparganii Rhizoma，Curcumae Rhizoma，Scutellariae barbatae Herba，etc.）and combined with DDP on Survivin and Caspase-3 expressions of human ovarian cancer ce111ine SKOV-3.METHODS A mode1 of SKOV-3 ce11 transp1anted tumor was estab1ished and fortymice with tumor were divided intomode1 contro1group，Daqiqi Decoction 1ow-，high-dose groups，DDP group and DDP combined with Daqiqi Decoction group，eightmice in each group. After successive administration for 21 d，the weights of tumor and vo1ume weremeasured，and the expressions of Survivin，Caspase-3 mRNA and protein were detected by reverse transcription po1ymerase chain reaction（PCR）and Western b1otmethod.RESULTS Each group's tumor weight and vo1ume were 1ess than those of themode1 contro1group（P＜0.01）.The detection resu1ts of reverse transcription PCR and Western b1ot showed that the expressions of Survivin mRNA and protein in treatment groupswere significant1y 1ower than those of themode1group （P＜0.01）.There was no statistica1difference as compared with the DDP group（P＜0.05），the DDP combined with the Daqiqi Decoction group was the 1owest，and the expressions of Caspase-3 mRNA and protein in the test group were significant1y higher than those in the mode1group（P＜0.01）.There was no statistica1 difference as compared with the DDP group（P＞0.05），and the DDP combined with Daqiqi Decoction group was the highest. CONCLUSION Themodified Daqiqi Decoction can achieve the inhibition of tumor ce11growth and promotion of apoptosis of tumor ce11s by reducing the expression of Survivin and raising the expression of Caspase-3.It a1so has synergistic effect in the combination with DDP on SKOV-3 ce11 transp1antation tumor.

KEY WORDS：Daqiqi Decoction；DDP（cis-dich1orodiaminep1atinum）；human ovarian cacer ce11 1ine SKOV-3；Survivin；Caspase-3

卵巢癌是女性生殖系統中死亡率最高的惡性腫瘤之一［1］。化學藥物治療是目前卵巢癌治療的重要手段［2］，其主要通過抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡發揮作用；而由凋亡相關基因調控的細胞凋亡是腫瘤細胞死亡的主要方式，因此通過檢測凋亡相關基因表達是判斷卵巢癌治療是否有效的重要標準之一。順鉑（cis-dich1orodiaminep1atinum，DDP）作為第一代的鉑類抗腫瘤藥物，是卵巢癌一線標準化療方案用藥，其具有作用強、活性高、廣泛抗腫瘤的特點；但化療藥物所產生耐藥性、敏感性降低和毒副作用直接導致了治療中后期的無效和預后不良［3］。因此，只有研究如何增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性、減輕毒副作用，制定合理有效的綜合治療方案才能提高生存率和延長生存期。

大七氣湯是《醫宗金鑒》中的抗癌經方，我們在臨床運用其加減方輔助順鉑治療卵巢癌患者得到了較好的反饋，具有增效減毒作用，故探討其作用機制十分迫切。本研究通過建立裸鼠SKOV-3細胞皮下移植瘤模型進行體內實驗，通過測量各組荷瘤鼠瘤體積、瘤重，并檢測腫瘤組織中Survivin和Caspase-3 mRNA和蛋白量的表達，從而進一步研究大七氣湯加減方對卵巢癌SKOV-3細胞移植瘤的影響，觀察大七氣湯加減方在人卵巢癌移植瘤裸鼠中的抗腫瘤作用和作用機制，為臨床治療該惡性腫瘤尋找更有效的藥物。

1 材料

1.1 實驗動物 BALB/c裸鼠，雌性，4～6周齡，體質量（16±2）g，購于重慶醫科大學動物實驗中心，生產許可證號SCXK（渝）2012-0002，飼養于恒濕（40％～60％）、恒溫（22～26℃）的獨立換氣凈化籠（individua11y venti1ated cages，IVC）中，裸鼠標準飼料、飲用水、墊料等一切與鼠接觸物品均經高壓滅菌處理。裸鼠適應性喂養1周后開始進行實驗。

1.2 實驗藥物、試劑 大七氣湯加減方主要組成有姜黃、三棱、莪術、半枝蓮、陳皮、青皮、桔梗、半夏、藿香、木香、益智仁、肉桂、炙甘草等，購于重慶醫科大學附屬第一醫院中藥房（所有藥材均由重慶醫科大學中醫藥研究室何先元教授鑒定），實驗前制備1 g/mL湯劑，高壓滅菌后4℃冰箱備用。RPMI-1640培養基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶（EDTA）均購自美國Hyc1one公司，二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司。0.9％氯化鈉注射液購于湖南康源制藥有限公司，注射用順鉑購于齊魯制藥有限公司。RNA提取試劑盒、反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒購于日本TaKaRa公司，兔抗人Survivin、Caspase-3單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

2 方法

2.1 細胞培養及動物模型建立 實驗細胞人卵巢癌漿液性乳頭狀囊腺癌SKOV-3細胞株購于美國物種保存中心（american type cu1ture co11ection，ATCC），細胞培養嚴格無菌操作，培養于含10％胎牛血清的RPMI-1640培養基中并置于5％ CO2、37℃條件下的培養箱內孵育。裸鼠皮下接種實驗在IVC動物房超凈工作臺內進行，收集對數生長期細胞，調整細胞密度至3×107細胞/mL，以0.2 mL/只（約含6×106個細胞）于右大腿外側皮下接種，接種后可見皮下出現一半球形突起。接種造模成功率為100％。

2.2 實驗分組與給藥 將造模成功的40只荷瘤鼠按照隨機數字表法［4］分為模型對照組、大七氣湯低劑量組、大七氣湯高劑量組、順鉑組、順鉑聯合大七氣湯組。給藥劑量根據《藥理實驗方法學》［5］制定，大七氣湯低劑量組中藥灌胃劑量為12 g/（kg.d），高劑量組中藥灌胃劑量為24 g/（kg.d），0.2 mL/10 g，模型對照組以等量生理鹽水灌胃，順鉑組腹腔注射3 mg/（kg.d）順鉑，順鉑聯合大七氣湯組為腹腔注射順鉑3 mg/（kg. d）聯合大七氣湯灌胃12 g/（kg.d）。大七鹽水灌胃每天1次，連續21 d；順鉑腹腔注射隔天注射1次，連續7次。

2.3 標本采集與檢測 于停止給藥后第2天進行標本采集，1％戊巴比妥腹腔麻醉后取出各皮下卵巢癌移植瘤組織于液氮罐中保存待測。

2.3.1 觀察荷瘤鼠一般狀態及腫瘤情況 給藥期間，每日觀察荷瘤鼠的飲食、精神狀態及腫瘤生長情況；每3日稱體質量并用游標卡尺分別測量瘤體的最長徑（a）和最短徑（b），計算腫瘤體積（依據公式V=1/2ab2），繪制腫瘤生長曲線，觀察腫瘤生長情況；腫瘤組織取出后稱瘤重并按照公式計算抑瘤率，抑瘤率（％）=（對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100％。

2.3.2 逆轉錄-聚合酶鏈反應法檢測Survivin和Caspase-3 mRNA的表達 瘤組織經勻漿、Trizo1裂解、提取瘤組織總RNA后逆轉錄成cDNA，進行RT-PCR。引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成，Survivin正向為5′-TCCGTGTCCTCGTCCTCCTAC-3′，反向為5′-CGCTGCCCAGGCTGTAGG-3′，擴增長度為219 bp；Caspase-3正向為5′-TTTTTCAGAGGGGATCGTTGTAG-3′，反向為5′-GCATGGCACAAAGCGACTGG-3′，擴增長度為244 bp；Gapdh正向：5′-AGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTC-3′，反向：5′-GCCCCGGCATCGAAGGTGGAAG-3′，擴增長度為725 bp。RT-PCR反應條件為94℃3 min，94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，30個循環，72℃延伸5 min，所得產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳成像掃描，Quantity one軟件對圖像進行分析，分別以Survivin/Gapdh和Caspase-3/Gapdh的灰度值比值來代表mRNA的相對表達水平。

2.3.3 蛋白質印跡法檢測Survivin和Caspase-3蛋白量的表達 提取移植瘤組織標本蛋白，BCA法分析測定蛋白質水平；將蛋白進行SDS-PAGE電泳并轉移到硝酸纖維素（NC）膜上，5％脫脂奶粉封閉2 h后，分別加入稀釋的兔抗人Survivin、Caspase-3單克隆抗體，ECL發光試劑盒進行顯色、曝光，凝膠成像系統對膠片進行掃描處理分析。

3 結果

3.1 荷瘤鼠一般情況、瘤重及瘤體積 SKOV-3細胞接種8 d后，裸鼠接種處皮下出現質地較硬的球狀突起。接種后觀察荷瘤鼠，模型對照組荷瘤鼠精神狀態與活動情況欠佳，體質量減輕速度較快，用藥組精神狀態與活動情況均較良好，體質量維持較好。各用藥組瘤重與模型對照組比較均有減輕（P＜0.01）；其中順鉑組瘤重較大七氣湯低劑量、高劑量組低，組間比較差異有統計學意義（P＜0.01）；順鉑聯合大七氣湯組瘤重最低，與其他治療組經組間比較差異有統計意義（P＜0.01）。見表1。

表1　各組荷瘤鼠瘤重和抑瘤率（n=8，±s）Tab.1 Each group of tumor weight and inhibitory rate （n=8，±s）

表1　各組荷瘤鼠瘤重和抑瘤率（n=8，±s）Tab.1 Each group of tumor weight and inhibitory rate （n=8，±s）

注：與模型對照組比較，*P＜0.01；與順鉑組比較，#P＜0.01；與順鉑聯合大七氣湯組比較，△P＜0.01

組別　　平均瘤/mg　　抑瘤率/％模型對照組　805.63±47.63#△-55.07大七氣湯低劑量組　636.75±43.36*#△　20.96大七氣湯高劑量組　491.13±33.52*#△　39.04順鉑組　423.88±34.68*△　47.39順鉑+大七氣湯組　362.00±32.71*#

根據腫瘤生長曲線顯示，從接種之日起到第14天，腫瘤生長速度相當，之后呈現不同生長趨勢，其中模型對照組瘤體積增長速度最快，稍后依次為大七氣湯低劑量組、大七氣湯高劑量組、順鉑組、順鉑聯合大七氣湯組；治療末次各治療組瘤體積標準差分別是模型對照組45.861，大七氣湯低劑量組21.758，大七氣湯高劑量組24.798，順鉑組13.999，順鉑+大七氣湯組13.988，治療末次各治療組瘤體積與模型對照組相比較均減小（P＜0.01），大七氣湯高劑量組、順鉑組、順鉑聯合大七氣湯組經組間比較差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1。

圖1　腫瘤生長曲線圖Fig.1 Tumor grow th curves

3.2 Survivin、Caspase-3 mRNA在各組中的表達情況 RT-PCR結果顯示，與模型對照組比較，各用藥組Survivin mRNA表達降低，而Caspase-3 mRNA表達增高，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。順鉑聯合大七氣湯組的Survivin mRNA表達最低，Caspase-3 mRNA表達最高，與大七氣湯低劑量組及順鉑組比較差異具有統計學意義（P＜0.01），見圖2、圖3。

M.標準 1.模型對照組 2.大七氣湯低劑量組 3.大七氣湯高劑量組 4.順鉑組 5.順鉑+大七氣湯組M.standard 1.mode1 contro1 group 2.Daqiqi Decoction group （1ow dose） 3.Daqiqi Decoction group（high dose）4.DDP group 5.DDP+Daqiqi Decoction group圖2　Survivin m RNA在各組腫瘤組織的表達Fig.2 mRNA expressions of Survivin in tumor tissues

圖3　Caspase-3 mRNA在各組腫瘤組織的表達Fig.3 mRNA expressions of Caspase-3 in tumor tissues

3.3 Survivin、Caspase-3蛋白在各組中的表達情況

Western b1ot結果顯示，模型對照組腫瘤組織中Survivin蛋白表達明顯高于各治療組（P＜0.01）；各治療組間，順鉑聯合中藥組Survivin蛋白表達量最低，與其余各組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；大七氣湯高劑量組與順鉑組Survivin蛋白表達量相比較差異無統計學意義（P＞0.05）。模型對照組腫瘤組織中Caspase-3蛋白表達量明顯低于各治療組（P＜0.01）；各治療組間，順鉑聯合大七氣湯組Caspase-3蛋白表達量最高，與其余各組相比較差異有統計學意義（P＜0.05）；大七氣湯高劑量組與順鉑組Caspase-3蛋白表達量相比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4、圖5。

圖4　Survivin蛋白在各組腫瘤組織的表達Fig.4 Protein expressions of Survivin in tumor tissues

圖5　Caspase-3蛋白在各組腫瘤組織的表達Fig.5 Protein expressions of Caspase-3 in tumor tissues

4 討論

凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）是一類重要的抗細胞凋亡因子，其中Survivin是目前為止發現的最強凋亡抑制因子，具有抑制細胞凋亡和調節細胞增殖的雙重功能，并且其高表達與腫瘤預后密切相關，主要通過抑制Caspase-3、9等酶的活性而發揮阻斷凋亡的作用［6］。Cohen等對Survivin在卵巢癌中的表達及相關性進行分析，發現Survivin基因的表達與卵巢癌的發生、演變及化療耐藥相關［7］。Caspase是近年來發現的一組存在于胞質溶膠中的凋亡執行蛋白，其中Caspase-3在各種原因導致的細胞凋亡中起著不可替代的作用，Caspase-3活性增加是細胞凋亡的重要機制，而它的失活或表達異常與多種腫瘤的發生發展有關［8］。

大七氣湯加減方具有理氣活血化瘀、軟堅散結解毒之功效。其中姜黃破血行氣，通經止痛；近年研究發現，姜黃素可以抑制腫瘤細胞生長和誘導其凋亡［9］；三棱、莪術具有破血消積之效，臨床上常相需而用；研究發現三棱具有抗血小板聚集、鎮痛、抗腫瘤等作用，而被認為是莪術特征成分的莪術醇在新近研究中發現能抑制腫瘤細胞生長及RNA的合成并誘導其凋亡［10-11］。半枝蓮的主要活性成分為黃酮類，具有清熱解毒、化瘀利尿之功效，是一種傳統的抗腫瘤中藥，郭麗華等發現半枝蓮5個黃酮類單體對SKOV-3細胞增殖均具有明顯抑制作用，并可增強卡鉑的細胞毒作用［12］。陳皮功效理氣健脾，燥濕化痰，錢士輝等研究發現其能使G2-M細胞減少，G0-G1期細胞增多，同時能促使癌細胞凋亡的作用［13］。木香能行氣止痛、調中導滯，近年來大量藥理學研究也證實木香中有效成分對多種癌細胞具有殺傷作用［14］。桔梗具有祛痰抗炎、免疫調節、抗腫瘤、保肝、心血管、鎮痛等作用［15］。半夏燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結，趙永娟研究發現其主要成分半夏多糖具有抗腫瘤作用，可抑制PC12細胞生長及增殖，誘導細胞凋亡［16］。因此，大七氣湯既符合中醫治療腫瘤清熱解毒，活血化瘀之原則，又跟現代藥理學理論研究相匹配，故療效可觀。

本實驗結果表明，大七氣湯加減方作用于卵巢癌荷瘤鼠，能減輕瘤重，各治療組與模型對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）；各組腫瘤體積治療末次后與模型對照組比較均減小（P＜0.01），大七氣湯高劑量組、DDP組、DDP聯合大七氣湯組經組間比較差異無統計學意義（P＞0.01）；瘤重和瘤體積均以DDP聯合大七氣湯組作用最強，提示大七氣湯輔助DDP化療可以增強荷瘤鼠對DDP的敏感性，提高抑瘤效果。通過檢測瘤體凋亡相關基因和蛋白的表達：DDP及大七氣湯高、低劑量組均能上調卵巢癌移植瘤Caspase-3表達及下調Survivin表達，發揮促凋亡作用，化療藥物DDP的作用優于單純大七氣湯高、低劑量組，且DDP聯合大七氣湯組效果強于所有治療組，亦說明單純大七氣湯治療可促進卵巢癌移植瘤凋亡，而大七氣湯聯合化療仍為最佳療效組。

綜上所述，大七氣湯加減方可抑制卵巢癌移植瘤細胞生長，促進移植瘤細胞凋亡，增強卵巢癌移植瘤對DDP敏感性，其機制可能是上調Caspase-3表達，下調Survivin表達，誘導裸鼠體內卵巢癌細胞凋亡。

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［臨 床］

*通信作者：陳 蓉（1963—），女，教授，碩士生導師，研究方向為婦科腫瘤與不孕癥中醫治療。Te1：13512337203，E-mai1：cr8093 @126.com

作者簡介：楊洋博君（1989—），女，碩士生，研究方向為中醫藥治療婦科腫瘤與不孕癥。Te1：13650534197，E-mai1：yybj1989@ 126.com

基金項目：重慶市衛生局中醫重點課題（2013-54號）

收稿日期：2014-08-10

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.006

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）01-0029-06

網絡出版日期：2015-04-07

網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20150407.1335.001.htm1