閃式提取及高速逆流色譜聯(lián)用提取高純度甘草苷

徐向君， 余金鵬， 袁 媛， 劉昌勝

（華東理工大學(xué)教育部醫(yī)用生物材料工程研究中心，上海200237）

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閃式提取及高速逆流色譜聯(lián)用提取高純度甘草苷

徐向君， 余金鵬， 袁 媛， 劉昌勝*

（華東理工大學(xué)教育部醫(yī)用生物材料工程研究中心，上海200237）

摘要：目的 研究從甘草渣中提取高純度甘草苷的方法。方法 利用閃式提取法快速提取甘草黃酮類化合物，高速逆流色譜法分離出高純度甘草苷。正交實(shí)驗(yàn)考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、提取時(shí)間、轉(zhuǎn)速4個(gè)因素對提取率的影響。在最優(yōu)工藝條件下制備出的甘草總黃酮經(jīng)過初步純化后，采用高速逆流色譜技術(shù)，以乙酸乙酯-甲醇-水（5∶3∶10）為兩相溶劑體系，從中分離高純度甘草苷。結(jié)果 閃式提取甘草渣中甘草總黃酮的優(yōu)化條件為90％乙醇，料液比（g/mL）1∶40，提取時(shí)間3 min，轉(zhuǎn)速16 000 r/min。從90 mg甘草總黃酮中分離得到35.71 mg甘草苷，純度可達(dá)到94.7％，收率為87.8％。結(jié)論 建立了閃式提取和高速逆流色譜技術(shù)聯(lián)用，用于制備高純度甘草苷的方法。

關(guān)鍵詞：甘草苷；閃式提取；高速逆流色譜

Isolation and purification of liquiritin from licorice residue by smashing tissue extraction and high-speed countercurrent chromatography

XU Xiang-jun， YU Jin-peng， YUAN yuan， LIU Chang-sheng*
（Engineering Research Center for Biomedical Materials，Ministry of Education，East China University of Science and Technology，Shanghai 2OO237，China）

KEY WORDS：1iquiritin；smashing tissue extraction；high-speed countercurrent chromatography（HSCCC）

1 前言

甘草（Glycyrrhizae Radix）是一種常用中草藥，其中的活性成分主要有三萜類（以甘草酸為主），甘草黃酮類，甘草多糖類等［1］。近年來，隨著甘草活性組分研究的深入，甘草黃酮類化合物也越來越受到人們的重視［2］，特別是其中單組份化合物，很有希望被開發(fā)成新型小分子藥物。如甘草苷是甘草中最主要的黃酮類物質(zhì)，屬于二氫黃酮類，具有很強(qiáng)的藥理活性，對于抗抑郁有特殊的療效［3］，同時(shí)具有抗氧化作用、神經(jīng)保護(hù)作用［4］、心肌細(xì)胞膜的保護(hù)作用［5］等。但甘草黃酮類化合物單組份的分離純化，一直是甘草研究中的難點(diǎn)，這是因?yàn)楦什蔹S酮種類多、含有量低、易變性。

閃式提取（smashing tissue extraction）技術(shù)是一種通過高速剪切作用破壞植物組織，而快速提取其中有效成分的新型提取技術(shù)［6］。該技術(shù)能在室溫條件、僅需幾十秒到幾分鐘完成對有效成分的提取［7-8］。與傳統(tǒng)提取技術(shù)相比，閃式提取技術(shù)更適用于黃酮、多酚等熱敏性、易氧化有效成分的提取［9］。

高速逆流色譜（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）是一種新型液-液分配色譜技術(shù)，樣品通過互不混溶的兩相溶劑間分配系數(shù)的不同而在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效分離制備［10］。相對于傳統(tǒng)的固-液柱層析技術(shù)，具有處理效率高、樣品損失小、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)［11-12］，被廣泛地應(yīng)用于制藥、化工等各個(gè)領(lǐng)域。

本課題擬先用閃式提取技術(shù)提取甘草渣中的甘草總黃酮，再利用高速逆流色譜分離純化出其中的甘草苷，以提高甘草的利用率和附加值。

2 材料與方法

2.1 原料與試劑 甘草來自寧夏拓明農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司。甘草渣為提取甘草酸后的渣滓，經(jīng)40℃真空干燥24 h以上制得。甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、三氯甲烷、乙腈、醋酸、正己烷等均為分析純，購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。甘草苷對照品購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司。

2.2 樣品中甘草總黃酮的測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取甘草苷對照品0.022 0 g，精密稱定，加入適量70％乙醇溶液超聲溶解，定容至100 mL，混勻，配置成質(zhì)量濃度為0.220 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL于1～5號10 mL量瓶中，分別加入70％乙醇溶液1.9、1.8、1.6、1.4、1.2 mL，使總體積為2 mL，然后加入10％ KOH溶液0.5 mL，混勻，室溫放置15 min，待充分顯色后，70％乙醇定容至10 mL，于410 nm波長處測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，以甘草苷質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，擬合得甘草總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線A=28.6C+0.075 2，r=0.999 9。

2.2.2 樣品中甘草總黃酮的測定［13］稱取樣品約0.02 g，70％乙醇溶液溶解，并定容至100 mL，量取1 mL樣品溶液，置于10 mL量瓶中，依次加入70％乙醇溶液1 mL、10％ KOH溶液0.5 mL，混勻，室溫顯色15 min，然后用70％乙醇定容至10 mL。于410 nm波長處測量吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品溶液中總黃酮的質(zhì)量濃度，進(jìn)而計(jì)算甘草總黃酮的含有量。

2.3 樣品中甘草苷的測定

2.3.1 色譜條件［14］Waters 2795高效液相色譜儀；使用Hypersi1C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特分析儀器有限公司）；流動(dòng)相為乙腈-0.05％冰醋酸，梯度洗脫（0→10 min→15 min→20 min，20％→20％→38％→55％）；檢測波長250 nm；柱溫20℃；體積流量1.0 mL/min。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取5.5 mg甘草苷對照品，70％乙醇溶液溶解于25 mL量瓶中，配制成0.22 g/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，取適量用流動(dòng)相稀釋成一系列質(zhì)量濃度梯度（0.014、0.028、0.055、 0.11、0.22 mg/mL）的待測標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣量為10 μL，記錄色譜圖，以峰面積（S）為縱坐標(biāo)，甘草苷質(zhì)量濃度（C，g/L）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線為S =（4.50C-0.017 9）× 106，r=0.999 8。

2.3.3 樣品中甘草苷的測定 稱取樣品約5 g，70％乙醇溶液溶解，并定容至25 mL，與標(biāo)準(zhǔn)曲線采用相同的色譜條件，根據(jù)峰面積計(jì)算樣品中甘草苷含有量。

2.4 閃式提取甘草渣中甘草總黃酮 稱取甘草渣0.5 g，按一定固液比加入乙醇水溶液，室溫閃式提取幾分鐘，過濾，測定濾液中甘草總黃酮濃度，并計(jì)算提取率。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法考察乙醇濃度（50％～90％）、固液比（1∶20～1∶40）、提取時(shí)間（1～3 min）、轉(zhuǎn)速（10 000～16 000 r/min）等因素對提取率的影響。詳見表1。

表1　閃式提取甘草總黃酮正交試驗(yàn)因素水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal test for smashing tissue extraction of total glycyrrhiza flavonoids

2.5 甘草總黃酮提取物的初步純化 將閃式提取所得提取液旋蒸干燥后，20倍體積去離子水加熱溶解。將甘草總黃酮的水溶液于等體積乙醚中萃取3次，再于等體積乙酸乙酯中萃取3次，干燥除去溶劑后，得到甘草總黃酮初提物。初步純化甘草總黃酮粗品后，HPLC法檢測甘草苷。

選用AB-8樹脂用于純化甘草總黃酮，以2.12 mg/mL的上樣質(zhì)量濃度，pH為5，上樣體積流量1.0 BV/h，以60％乙醇為洗脫劑，洗脫液經(jīng)冷凍干燥揮去溶劑后，得到黃色粉末狀甘草總黃酮粗提物500 mg，冷藏備用。

2.6 高速逆流色譜法分離純化甘草苷

2.6.1 溶劑體系分配系數(shù)K的確定 一個(gè)穩(wěn)定的兩相溶劑體系是否適合于目標(biāo)物質(zhì)的分離，通常要看物質(zhì)在該溶劑體系中的分配系數(shù)是否在一個(gè)合適的范圍內(nèi)［15］。根據(jù)高速逆流色譜分離黃酮類化合物的相關(guān)報(bào)道［16-17］，選取了10種溶劑體系通過分配系數(shù)的測定來進(jìn)行篩選。分配系數(shù)的測定方法：稱取5.5 mg甘草黃酮樣品，分別加入己達(dá)到分配平衡的上、下相5 mL，充分振蕩溶解。用移液槍分別移取相同體積的溶有樣品的上相溶液和下相溶液，待溶液揮干后，再用流動(dòng)相溶解定容至3 mL。利用HPLC法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定溶劑體系上、下相所含樣品的質(zhì)量濃度，以上相中組分質(zhì)量濃度CU與下相中組分質(zhì)量濃度CL的比來求得樣品在該溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)K=CU/CL。

2.6.2 HSCCC分離方法 稱取甘草總黃酮粗品90 mg，加入溶劑系統(tǒng)的上、下相各10mL，使之完全溶解，作為HSCCC的進(jìn)樣液。將上相以10 mL/min的速度泵入HSCCC分離管，待固定相充滿整個(gè)分離管后，開啟循環(huán)水浴，并將溫度設(shè)定為25℃。再開啟HSCCC主機(jī)，旋轉(zhuǎn)方向?yàn)轫槙r(shí)針，使轉(zhuǎn)速逐漸增加到800 r/min，同時(shí)以1.0 mL/min的流量泵入下相，待下相從柱出口流出，上相不再流出，表明上下相在分離管中達(dá)到平衡，由進(jìn)樣閥注人先前配制好的進(jìn)樣液，以250 nm波長進(jìn)行監(jiān)測，根據(jù)色譜圖，手動(dòng)收集各色譜峰組分。收集到的各組分樣品溶液，蒸干后，用高效液相色譜法檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 閃式提取甘草渣中甘草總黃酮

3.1.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)四因素三水平正交試驗(yàn)表，安排9組試驗(yàn)，每組重復(fù)3次以上，所得平均值列于表2，相應(yīng)的誤差線繪于圖1。由圖可知，所得數(shù)據(jù)的相對誤差較小，重復(fù)性好，數(shù)據(jù)較為可靠。表2中，各因素同一水平的提取率求和得K1、K2、K3，相對應(yīng)的平均值為k1、k2、k3，各因素的極差R為k1、k2、k3中最大值與最小值之差，可以反映該因素的影響大小。正交試驗(yàn)方差分析F的檢驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，4個(gè)因素對提取率的影響都不顯著，可能是因?yàn)樵搶?shí)驗(yàn)存在一定的誤差，且誤差自由度較小，使檢驗(yàn)的靈敏度低。因此，可從表2中的極差R中選擇各因素對甘草總黃酮提取率的影響大小，依次為B（固液比）＞A（乙醇濃度）＞C（提取時(shí)間）＞D（轉(zhuǎn)速），而且B、A遠(yuǎn)大于C、D，這說明B（固液比）和A（乙醇體積系數(shù)）對提取率的影響要遠(yuǎn)大于C（提取時(shí)間）和D（轉(zhuǎn)速）。由k1、k2、k3的大小可知，各因素的最優(yōu)水平為A3B3C3D3，即閃式提取的最佳工藝條件為料液比（g/mL）1∶40，乙醇體積分?jǐn)?shù)90％，提取時(shí)間3 min，轉(zhuǎn)速16 000 r/min。閃式提取技術(shù)較傳統(tǒng)提取方法具有省時(shí)、能室溫提取、適用范圍更廣，不破壞成分、可選溶劑種類多，節(jié)能環(huán)保、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。

表2　閃式提取甘草總黃酮的正交試驗(yàn)Tab.2 Orthogonal tests for smashing tissue extraction of total glycyrrhiza flavonoids

圖1　閃式提取甘草總黃酮的正交試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Orthogonal test results of smashing tissue extraction of glycyrrhiza flavonoids

表3　方差分析Tab.3 Analysis of variance

3.1.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)上述正交試驗(yàn)所得最佳工藝條件，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，以A3B3C3D3為提取條件，得到甘草總黃酮提取率如表4所示。結(jié)果說明，正交試驗(yàn)所得工藝條件較好，且RSD為1.49％，表明該工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好。

表4　驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Verification test results

3.2 甘草總黃酮提取物的初步純化 將閃式提取所得提取液旋蒸干燥后，20倍體積去離子水加熱溶解。將甘草總黃酮的水溶液于等體積乙醚中萃取3次，再于等體積乙酸乙酯中萃取3次，干燥除去溶劑后，得到甘草總黃酮初提物。經(jīng)過初步純化的甘草總黃酮粗品使用HPLC檢測，甘草苷含有量為169 mg/g。

選用AB-8樹脂用于純化甘草總黃酮，以2.12 mg/mL上樣，pH為5，上樣體積流量1.0 BV/h，以60％乙醇為洗脫劑，洗脫液經(jīng)冷凍干燥揮去溶劑后，得到黃色粉末狀甘草總黃酮粗提物500 mg，冷藏備用。甘草苷含有量為428 mg/g。

由于甘草黃酮各組分的極性相似，傳統(tǒng)大孔樹脂柱層析技術(shù)難以將其中的單一組分完全分離出來，因此需要更先進(jìn)的技術(shù)（如高速逆流色譜法）進(jìn)一步純化其中的甘草苷。

3.3 高速逆流色譜法分離純化甘草苷

3.3.1 溶劑體系的篩選 溶劑系統(tǒng)是決定HSCCC分離樣品效果的最關(guān)鍵因素。不同的溶劑系統(tǒng)由于黏度、極性和密度等性質(zhì)的差異，對相同的成分會(huì)產(chǎn)生不同的溶解、分配能力，因而形成分配系數(shù)的差異。根據(jù)色譜理論，利用HSCCC分離樣品的必要條件是目標(biāo)物能穩(wěn)定的溶于兩相溶劑；目標(biāo)物在兩相中具有合適的分配系數(shù)，必須在0.5和2之間。若遠(yuǎn)小于1，樣品會(huì)很快隨流動(dòng)相流出，達(dá)不到分離效果；若遠(yuǎn)大于1，樣品的出峰時(shí)間會(huì)延長，形成寬峰。根據(jù)表5的數(shù)據(jù)，應(yīng)用乙酸乙酯-甲醇-水（5∶3∶10），乙酸乙酯-甲醇-水（3∶2∶5）、三氯甲烷-甲醇-n-丁醇-水（8∶8∶1∶4）作為兩相時(shí)，K值在合適的范圍內(nèi)。其中，選取乙酸乙酯-甲醇-水（5∶3∶10）進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，樣品可以較好的從其他組分中分離出來，見表5。

表5　甘草苷在不同溶劑體系下的分配系數(shù)Tab.5 Partition coefficient of liquiritin in different solvent system s

3.3.2 HSCCC分離方法 使用乙酸乙酯-甲醇-水（5∶3∶10）作為兩相溶劑系統(tǒng)。分離時(shí)間80 min，根據(jù)HSCCC圖譜，第30分鐘收集到組分，通過HPLC檢測，組分A為目標(biāo)物質(zhì)（圖2）。經(jīng)干燥后，得到干燥物35.71 mg，收率為87.8％。獲得甘草苷的純度為94.7％（圖3）。

A.甘草苷A.1iquiritin圖2　HSCCC分離圖譜Fig.2 Separation diagram of HSCCC

A.甘草苷A.1iquiriti圖3　HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram

對于成分較復(fù)雜的天然物質(zhì)組分，傳統(tǒng)的色譜技術(shù)難將其完全分離，高速逆流色譜技術(shù)具有高效分離、低費(fèi)成本、工藝易放大、回收率高等優(yōu)點(diǎn)，為天然藥物復(fù)雜混合物中特定活性成分的高純度單體的制備與分離純化帶來了更優(yōu)的解決方案。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用閃式提取與高速逆流色譜聯(lián)用的方法來制備高純度甘草苷。閃式提取正交優(yōu)化的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)90％，料液比（g/mL）1∶40，提取時(shí)間3 min，轉(zhuǎn)速16 000 r/min。經(jīng)初步純化后，以乙酸乙酯-甲醇-水（5∶3∶10）為HSCCC兩相溶劑系統(tǒng)，進(jìn)一步分離純化甘草苷，一次進(jìn)樣甘草總黃酮初提物90 mg，可得到35.71 mg甘草苷，純度為94.7％。因此，所建立的閃式提取及HSCCC聯(lián)用的方法用于分離純化甘草渣中的甘草苷是可行的，該方法在快速提取、分離和純化天然產(chǎn)物方面具有較好的發(fā)展?jié)摿蛷V泛的應(yīng)用前景。

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*通信作者：劉昌勝（1967—），男，教授，從事生物材料研究。Te1：13801823622，E-mai1：1iucs@ecust.edu.cn

作者簡介：徐向君（1990—），男，碩士，從事中草藥的提取純化工作。Te1：15026535586，E-mai1：xxj0768@163.com

收稿日期：2015-03-23

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.015

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）01-0072-05