HPLC-ELSD法同時測定不同產地白果藥材中4種萜內酯類成分

張群群， 李慧芬，2， 張學蘭，2*， 吳 鵬， 王均秀， 宋夢晗， 趙 鑫

（1.山東中醫藥大學，山東濟南250355；2.國家中醫藥管理局中藥炮制傳承基地，山東濟南250355）

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HPLC-ELSD法同時測定不同產地白果藥材中4種萜內酯類成分

張群群1， 李慧芬1，2， 張學蘭1，2*， 吳 鵬1， 王均秀1， 宋夢晗1， 趙 鑫1

（1.山東中醫藥大學，山東濟南250355；2.國家中醫藥管理局中藥炮制傳承基地，山東濟南250355）

摘要：目的 建立HPLC-ELSD法同時測定白果藥材中白果內酯和銀杏內酯A、B、C。方法 白果乙酸乙酯萃取物的分析采用Kromasi1C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1％甲酸水（38∶62）；柱溫30℃，體積流量0.8 mL/min。結果 白果內酯和銀杏內酯A、B、C分別在1.01～40.40 μg、1.03～41.20 μg、2.37～94.80 μg、1.51～60.40 μg范圍內線性關系良好（r＞0.999 5），平均回收率在97.3％～99.2％之間。5個不同產地（山東濟南、臨沂、泰安，廣西桂林和江蘇泰興）白果藥材中四者的含有量分別為75.55～219.73、54.79～135.88、200.37～853.39、119.31～498.06 μg/g。結論 白果中4種萜內酯類成分的總含有量以江蘇省泰興市產者為最高。

關鍵詞：白果；白果內酯；銀杏內酯A；銀杏內酯B；銀杏內酯C；產地；HPLC-ELSD

白果為銀杏科植物銀杏Ginkgo biloba L.的干燥成熟種子，其味甘、苦、澀，性平，有毒，具有斂肺定喘、止帶縮尿的功能［1］，含有銀杏酸、萜內酯、黃酮等成分［2-3］，其中萜內酯類化合物有銀杏內酯A、B、C和白果內酯等［4-5］。研究表明，銀杏酚酸類成分具有致敏性、細胞毒性和免疫毒性，為白果的主要毒性成分［6］；白果萜內酯是血小板活化因子的拮抗劑，對心腦血管疾病具有獨特的藥理作用，廣泛用于治療和預防心腦血管疾?。?］；白果內酯具有提高癡呆小鼠的學習記憶功能和抗卡氏肺孢子蟲肺炎作用［8-9］。關于白果藥材的質量標準，《中國藥典》2010年版一部僅收載了成品的外觀性狀、粉末的顯微特征及薄層色譜的定性鑒別，缺乏有效成分或指標成分的含有量測定指標和參數，難以控制白果藥材的質量。李轉梅等［10］建立了白果藥材及炮制品中白果酸和總銀杏酸含有量的測定方法，羅曼等［11］建立了白果仁萜內酯類成分的HPLC-ELSD指紋圖譜定性分析方法，但未見對白果中萜類內酯成分定量測定的相關報道。目前，銀杏葉及其制劑中該類成分的定量測定方法有HPLC-ELSD、HPLCMS/MS、UPLC-TQ-MS等［12-14］。本實驗建立了HPLC-ELSD同時測定白果藥材中白果內酯和銀杏內酯A、B、C的方法，并測定了5個不同產地、批次白果藥材中這些成分的含有量，可為其質量控制和評價提供科學依據。

1 儀器與試藥

Waters e2695型HPLC色譜儀、e2424型蒸發光散射檢測器（美國Waters公司）；FA1604N型電子天平（十萬分之一，上海精密科學儀器有限公司）；KQ-250E型醫用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C對照品（中國食品藥品檢定研究院，供含有量測定用，批號分別為110865-200605、110862-200608、110863-200508、110864-200906）。HPLC用甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

白果藥材的產地分別為山東省濟南市長清區、臨沂市、泰安市、廣西省桂林市、江蘇省泰興市，經山東中醫藥大學中藥鑒定教研室李峰教授鑒定為銀杏科植物銀杏Ginkgo biloba L.的成熟種子。除去雜質，50℃下烘干，備用。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取白果內酯5.05 mg、銀杏內酯A 5.15 mg、銀杏內酯B 4.74 mg、銀杏內酯C 3.02 mg，置于1 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液。分別吸取四種對照品溶液0.2、0.2、0.5、0.5 mL，置于同一2 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含白果內酯0.505 mg、銀杏內酯A 0.515 mg、銀杏內酯B 1.185 mg、銀杏內酯C 0.755 mg的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取各樣品粉末（過3號篩）5 g，分別置于索氏提取器中，加甲醇80 mL，水浴回流提取6 h至無色，減壓回收甲醇蒸干，殘渣加水20 mL，70℃水浴溫熱使其溶解。再往里加2％稀鹽酸溶液2滴，乙酸乙酯萃取3次（15、10、10 mL），合并提取液，5％乙酸鈉溶液20 mL洗滌，洗液再用乙酸乙酯10 mL洗滌，合并乙酸乙酯液及洗液，純水洗滌2次，每次20 mL，合并水洗液，10 mL乙酸乙酯洗滌，合并乙酸乙酯液，回收至干，殘渣用甲醇溶解，轉移至1 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 色譜條件 Kromasi1C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1％甲酸水（38∶62）；柱溫30℃；體積流量0.8 mL/min；蒸發光檢測器的漂移管溫度60℃；載氣流量25 L/min。在上述條件下，白果內酯和銀杏內酯A、B、C與其他成分均可達到基線分離，見圖1。

1.白果內酯 2.銀杏內酯C 3.銀杏內酯A 4.銀杏內酯B1.bi1oba1ide 2.ginkgo1ide C 3.ginkgo1ide A 4.ginkgo1ide B圖1　混合對照品與白果藥材的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of m ixed reference substances and Ginkgo Semen sam ples

2.4 線性關系考察 分別精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液2、10、20、40、80 μL，注入HPLC色譜儀，在“2.3”項色譜條件下進行測定，記錄色譜峰峰面積，以進樣量（μg）對數為橫坐標（X），峰面積對數為縱坐標（Y）進行線性回歸，計算回歸方程。結果，各成分線性關系良好，見表1。

表1　4種內酯類成分的線性關系Tab.1 Linear relationships of four terpene lactones

2.5 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液（山東省濟南市長清區）10 μL，注入HPLC色譜儀，連續進樣6次，測定白果內酯和銀杏內酯A、B、C的峰面積。結果，RSD分別為1.5％、1.5％、1.5％和1.8％，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液（山東省濟南市長清區）適量，室溫下分別在0、2、4、8、12、24 h進樣10 μL，測定白果內酯和銀杏內酯A、B、C的峰面積。結果，RSD分別為1.6％、1.3％、1.9％、1.8％，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.7 重復性試驗 精密稱取同一產地白果藥材粉末（山東省濟南市長清區，過3號篩）6份，每份5 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，在“2.3”項色譜條件下測定，計算白果內酯和銀杏內酯A、B、C的含有量。結果，四種成分的平均含有量分別為80、57、204、141 μg/g，RSD分別為1.1％、1.9％、1.9％、2.5％，表明該方法重復性較好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的白果藥材（山東省濟南市長清區，過3號篩）6份，每份2.5 g，精密加入白果內酯（0.019 51 g/L）、銀杏內酯A（0.013 26 g/L）、銀杏內酯B （0.050 92 g/L）、銀杏內酯C（0.034 51 g/L）對照品溶液1 mL，甲醇補足至80 mL，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，在“2.3”項色譜條件下測定，結果見表2。

2.9 樣品測定 精密吸取混合對照品和供試品溶液各10 μL，注入HPLC色譜儀進行分析測定，計算樣品中4種內酯類成分的含有量，結果見表3。

3 小結與討論

白果萜內酯類成分在紫外末端有吸收，HPLCUV測定時靈敏度低，雜質干擾大，重復性差。本實驗首次建立了HPLC-ELSD法同時定量測定不同產地白果藥材中白果內酯和銀杏內酯A、B、C的含有量，對提取溶劑50％、70％、100％甲醇進行比較，發現以甲醇為溶劑提取的4種萜內酯成分總含有量最高；對甲醇索式回流6 h和甲醇超聲1 h進行比較，發現前者提取效果較好，而且色譜峰峰形理想，同時還對流動相等參數進行了考察。綜上所述，該方法簡便、可靠、有效，可用于白果藥材中白果內酯和銀杏內酯A、B、C成分的測定，為其質量控制提供一定參考。

不同產地、批次白果藥材中白果內酯和銀杏內酯A、B、C成分的含有量相差較大，四者總含有量最高者是最低者的4倍。因此，建議將這4種成分的含有量限度納入白果藥材質量標準中，以期更全面地控制其質量。

由于白果中內酯類成分的含有量較低，測定時取樣量大，而且甲醇提取液中含有較多色素等雜質，干擾測定，對儀器損害嚴重，故需作進一步純化。本實驗采用乙酸乙酯萃取法，將四種萜內酯類成分充分轉移到乙酸乙酯中，可排除色譜測定時雜質的干擾，而且它們與其他成分分離度良好。

表2　加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.2 Resu lts of recovery tests（n=6）

表3　4種萜內酯成分含有量的測定結果（μg/g，n=2）Tab.3 Determ ination results of the contents of four terpene lactones（μg/g，n=2）

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Simultaneous determ ination of four terpene lactones in Ginkgo Semen from dif-

ferent grow ing areas by HPLC-ELSD

ZHANG Qun-qun1， LI Hui-fen1，2， ZHANG Xue-1an1，2*， WU Peng1， WANG Jun-xiu1， SONG Meng-han1， ZHAO Xin1
（1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 25O355，China；2.Traditional Chinese Medicine Processing Technology Helitage Base，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Jinan 25O355，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish amethod for simu1taneous1y determining the contents of bi1oba1ide and ginkgo1-ide A，B，C in Ginkgo Semen by HPLC-ELSD.METHODS The ana1ysis of Ginkgo Semen ethy1acetate extract was performed on Kromasi1C18co1umn（250 mm×4.6 mm，5 μm），mobi1e phasewasmethano1-0.1％ methanoic acid water（38∶62），co1umn temperature wasmaintained at30℃，and f1ow rate was 0.8 mL/min.RESULTS Bi1oba1ide and ginkgo1ide A，B，C had good 1inear re1ationships in the ranges of 1.01 -40.40 μg，1.03 -41.20 μg，2.37 -94.80 μg and 1.51 -60.40 μg，respective1y（r＞0.999 5）.Their average recoveries were 97.3％ -99.2％.The contents of these four consitituents in Ginkgo Semen from five different growing areas（Jinan，Linyi，Taian in Shandong，Gui1in in Guangxi and Taixing in Jiangsu）were 75.55 -219.73 μg/g，54.79 -135.88 μg/g，200.37 -853.39 μg/g and 119.31 -498.06 μg/g，respective1y.CONCLUSION The tota1 contents of four terpene 1actones in Ginkgo Semen is the highest in Taixing（Jiangsu）.

KEY WORDS：Ginkgo Semen；bi1oba1ide；ginkgo1ide A；ginkgo1ide B；ginkgo1ide C；growing areas；HPLC-ELSD

*通信作者：張學蘭（1963—），女，教授，從事中藥新藥研發與中藥炮制原理研究。Te1：（0531）89628081，E-mai1：zhang8832440@sina.com

作者簡介：張群群（1988—），女，碩士，從事中藥新藥研發與中藥炮制原理研究。Te1：18753151090，E-mai1：zhangqunqun01@163.com

基金項目：濟南市高校自主創新計劃項目（201303027）

收稿日期：2015-07-13

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.030

中圖分類號：R284.1

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）01-0133-04