馬錢苷、莫諾苷對高糖致心肌細胞損傷的保護機制研究

趙文望， 皮文霞， 蔡寶昌， 封曉鵬

（南京中醫藥大學，江蘇南京210023）

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馬錢苷、莫諾苷對高糖致心肌細胞損傷的保護機制研究

趙文望， 皮文霞*， 蔡寶昌， 封曉鵬

（南京中醫藥大學，江蘇南京210023）

摘要：目的 觀察馬錢苷、莫諾苷對高糖誘導損傷的心肌細胞增殖、凋亡以及心肌細胞蛋白表達的影響來研究其對心肌細胞的保護作用。方法 體外培養乳大鼠原代心肌細胞，建立模型組（葡萄糖終濃度為30 mmo1/L），空白組（不加藥及葡萄糖），馬錢苷和莫諾苷低、中、高劑量組（培養基中加入終質量濃度25、50、100 μg/mL），依次用四唑鹽比色法（MTT法）、DNA斷裂的原位末端標記法（TUNEL法）觀察心肌細胞增殖和凋亡情況、蛋白質印跡法（Western b1ot法）觀察心肌細胞的B淋巴細胞瘤-2基因（Bc1-2）、Bc1-2相關X蛋白（Bax）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 （Caspase-3）蛋白表達水平。結果 MTT法顯示，與模型組比較，不同劑量馬錢苷組和莫諾苷組，對糖尿病心肌細胞的增殖有不同程度的促進作用。TUNEL法表明馬錢苷、莫諾苷均顯著抑制心肌細胞凋亡，與模型組比較有顯著差異。Western b1ot法中，馬錢苷、莫諾苷能促進Bc1-2蛋白表達，抑制Bax蛋白表達和Caspase-3酶活性，來抑制心肌細胞的凋亡。結論 馬錢苷和莫諾苷均具有促進心肌細胞增殖、抑制其凋亡的現象，具有保護心肌細胞的作用。

關鍵詞：馬錢苷；莫諾苷；心肌細胞；糖尿病心肌病；保護機制

近年來，糖尿病的病發率逐年升高，繼發于糖尿病的糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）也逐漸成為糖尿病患者死亡的主要原因之一，其發病率高，危害性大，特發于糖尿病患者、除外冠心病、高血壓等疾病，以心室舒張或收縮功能障礙及心臟結構改變為主要表現，最終進展為心力衰竭的一種疾病［1］。

山茱萸是山茱萸科植物山茱萸（Cornus officinalis Sieb.et Zucc.）干燥成熟果肉［2］，主治腰膝酸痛、崩漏帶下、內熱消渴等，屬中醫常用的治消渴良藥之一［3］。其主要成分為馬錢苷、莫諾苷、熊果酸等。現代研究中，Yamabe［4］等表明，山茱萸中環烯醚萜總苷能促進糖尿病并發的腎臟損傷有關物質的代謝。劉洪［5］等表示山茱萸環烯醚萜總苷對II型糖尿病并發心臟病變有一定的保護作用。故本實驗主要研究環烯醚萜總苷中主要活性成分馬錢苷和莫諾苷對高糖致心肌細損傷的保護作用。通過高糖刺激乳大鼠原代心肌細胞，培養模擬人體糖尿病誘導的心肌細胞損傷模型，通過MTT法、TUNEL法和Western b1ot法觀察不同濃度的馬錢苷、莫諾苷對糖尿病心肌細胞的增值和凋亡的影響，初步闡明馬錢苷、莫諾苷治療糖尿病心肌病的作用機制。

1 材料與儀器

1.1 動物 新生1～2 d齡SD大鼠，雌雄不限，由南京醫科大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK（蘇）2008-0004。

1.2 儀器 YXQ-LS-50立式壓力鍋（上海博訊實業有限公司）；SW-CJ-1F超凈工作臺（江蘇蘇凈集團有限公司）；3111 CO2恒溫培養箱（美國FORMA公司）；TGL-16M離心機（長沙湘儀離心機有限公司）；THZ-312臺式恒溫振蕩器（上海精宏實驗設備有限公司）；HY-4脫色搖床（江蘇正基儀器有限公司）；IX51生物倒置顯微鏡（OLYMPUS，日本）；XW-80A渦旋振蕩器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；BL310分析天平（德國Sartorius公司）；UV-2450紫外光度儀（日本SHIMADZU公司）。

1.3 藥品與試劑 青、鏈霉素混合液（批號KGY002）、SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒（批號KGP113）購自南京凱基生物科技發展有限公司；胰蛋白酶-EDTA消化液（批號KGY001）、Western b1ot檢測試劑盒（批號KGP1201）、ECL檢測試劑盒（批號KGP1123）、Braford蛋白含量檢測試劑盒（批號KGA801）均購自南京凱基生物科技發展有限公司；二甲基亞砜（上海久億化學試劑有限公司）；DMEM培養基和胎牛血清（美國Gibco公司）；四甲基偶氮唑鹽（北京索來寶科技公司）；PBS（無Ca2 +、Mg2 +，pH 7.2）：NaC1 8.0 g，Na2HPO4.12H2O 2.9 g，KC1 0.2 g，KH2PO40.2 g，加超純水至1 000 mL，攪拌使完全溶解，調整pH至7.2，0.22 μm濾膜過濾，4℃保存。馬錢苷、莫諾苷由本實驗室從山茱萸中分離、純化得到，經HPLC檢測，純度＞99％。

2 方法

2.1 馬錢苷和莫諾苷的提取分離 取山茱萸生品500 g，6～8倍75％乙醇水浴回流提取2次，每次1 h，過濾，合并2次濾液，減壓回收溶劑至無醇味，得山茱萸提取液。稱取2倍生藥量的大孔樹脂，用95％乙醇浸泡過夜，樹脂處理干凈后，裝柱，用水洗脫至無醇味。取山茱萸提取液過徑高比為1∶12的HPD400的大孔樹脂柱，收集8倍量30％乙醇洗脫劑，減壓濃縮至500 mL。用等體積正丁醇萃取5次，60℃減壓濃縮正丁醇萃取液至適量，轉移至蒸發皿蒸干，得浸膏。用5％甲醇水溶液溶解浸膏，通過YMC反相硅膠柱層析，使用甲醇-水溶劑系統按5％、10％、20％甲醇-水梯度洗脫，收集餾分。根據TLC法檢驗，合并斑點相同的餾分。將10％和20％部位洗脫的相同斑點的收集液冷凍干燥，經重結晶后得馬錢苷和莫諾苷單體，經HPLC檢測，純度＞99％。

2.2 實驗分組 取原代乳鼠培養的心肌細胞隨機分為（1）空白組，不加藥及葡萄糖；（2）模型組，葡萄糖終濃度為30 mmo1/L；（3）給藥組，葡萄糖終濃度為30 mmo1/L，馬錢苷、莫諾苷以不同濃度給藥（培養基中加入終質量濃度25、50、100 μg/mL），分為低、中、高劑量組。

2.3 新生大鼠心肌細胞培養 新生1～2 d齡SD大鼠，在75％酒精中浸泡5 min。左手抓握乳鼠，右手持眼科剪，在無菌條件下剪開胸骨劍突下稍左側的皮膚。換眼科剪，在胸骨劍突下稍左側打開胸腔，左手輕輕用力，心臟躍出，用眼科彎鑷取心臟心尖部，置于預溫的PBS中，漂洗3次。將漂洗后的心尖在少量PBS中用眼科剪剪成約1 mm3的小塊，靜止2 min棄上清，向剩余的心肌組織中加入0.125％胰酶溶液10～15 mL，消化10 min，重復消化，待組織塊基本消失時，將消化后的細胞懸液以1 000 r/min離心5 min，加入適量DMEM+10％ FBS重懸細胞，細胞懸液用無菌200目過濾器過濾至培養皿中，置37℃、5％ CO2培養箱中培養。

2.4 MTT顯色法 分別取對數生長期的細胞，消化、計數、配置成5×104/mL的細胞懸液，按100 μL每孔接種于96孔板中（每孔5×103個細胞），設3個復孔，置于37℃，5％ CO2培養箱中培養24 h后棄去培養液，PBS清洗2次，用完全培養基稀釋藥物至所需濃度，加入含有不同質量濃度藥物的培養基200 μL，模型組加入含有0.2％ DMSO的培養基200 μL，空白組只加200 μL DMEM培養基，置于37℃，5％ CO2培養箱中培養72 h后，每孔加入5 g/LMTT溶液20 μL，繼續培養4 h后，棄去培養液，加入150 μL DMSO/孔終止反應，振蕩10 min，使活細胞中被MTT還原的甲瓚結晶完全溶解。在酶聯儀讀取光密度值（D值），檢測波長490 nm。

2.5 TUNEL染色法 將對數生長期的細胞消化接種到6孔板中，次日，待細胞貼壁后，根據“2.2”項設置組別與劑量加入相應的含藥培養基，同時設立空白組。待藥物作用72 h后，用0.25％胰酶（不含EDTA）消化收集細胞。用PBS洗滌細胞2次（2 000 r/min離心5 min），收集不多于1×106的細胞。將細胞涂于載玻片上，自然晾干細胞涂片；再將細胞涂片浸入固定液，室溫（15～25℃）固定1 h，然后PBS漂洗2次。細胞涂片浸入封閉液中，室溫（15～25℃）封閉10 min，PBS漂洗2次。細胞涂片浸入通透液中，冰上（2～8℃）促滲2 min，每個樣本滴加100 μL末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）反應液，避光濕潤37℃反應1 h，在PBS浸泡5 min，清洗3次。加酶標親和素，用DAB法顯色，終止顯色，再經復染和封片，最后在光學顯微鏡觀察。

2.6 Western b1ot法檢測蛋白表達 將體外培養的心肌細胞，吸去培養基后，冷PBS洗2次，在加入適量胰蛋白酶消化液，37℃消化，離心。處理之后按照試劑盒的要求將細胞裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑按比例混合好之后，分別加至各培養皿中，置于4℃搖床平臺上，溫和振蕩15 min，14 000 r/min，4℃離心15 min，取上清為全蛋白提取物，分裝保存于-70℃。Bradford法通過繪制的標準曲線，測得蛋白濃度。將樣品蛋白上清與1oading buffer按比例混合好之后，SDS-PAGE膠進行電泳，轉膜結束后，將硝酸纖維素（NC）膜放入培養皿中，加入含5％脫脂奶粉的封閉液，搖床振蕩1.5～2 h進行封閉，之后洗膜，然后先后加入二抗，ECL化學發光檢測蛋白條帶，使用Ge1-Pro32軟件對結果進行灰度分析。

2.7 統計分析 實驗數據采用SPSS 17.0統計軟件分析完成，計量數據資料先進行正態分布檢驗，符合正態分布者，兩組間比較采用獨立t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；不符合正態分布者進行數據轉化使其符合正態分布或采用非參數檢驗。以P＜0.05、P＜0.01作為顯著性和極顯著性差異的標準。

3 結果

3.1 MTT法檢測馬錢苷、莫諾苷對高糖致心肌細胞的增殖的影響 實驗結果如表1所示，30 mmo1/L的葡萄糖作用心肌細胞24 h后，其凋亡率增加（P＜0.05）。與模型組比較，馬錢苷和莫諾苷可以明顯促進糖尿病心肌細胞的增殖，隨著培養時間的延長，糖尿病心肌細胞的增殖情況不同。作用24 h后，馬錢苷和莫諾苷低、中、高劑量組促進糖尿病心肌細胞的增殖不顯著（P＞0.05）；作用48 h后，馬錢苷高、中組促進糖尿病心肌細胞增殖顯著（P＜0.05），莫諾苷高劑量組促進糖尿病心肌細胞增殖顯著（P＜0.05）；作用72 h后，馬錢苷和莫諾苷低、中、高劑量組促進糖尿病心肌細胞的增殖非常顯著（P＜0.01）。

3.2 TUNEL法檢測馬錢苷、莫諾苷對高糖致心肌細胞凋亡的影響 如表2和圖1所示，模型組中糖尿病心肌細胞凋亡率增加，與空白組比較，有顯著性差異（P＜0.01）。與模型組比較，馬錢苷低、中、高劑量組能降低糖尿病心肌細胞的凋亡率，與模型組比較有顯著差異（P＜0.05）；莫諾苷低、中、高劑量組能降低糖尿病心肌細胞的凋亡率，與模型組比較有顯著差異（P＜0.05）。

表1　馬錢苷和莫諾苷對高糖致心肌細胞增殖的影響（x± s，n=6）

表2　Tunel法檢測莫諾苷和馬錢苷對高糖致心肌細胞凋亡的影響（±s，n=3）

表2　Tunel法檢測莫諾苷和馬錢苷對高糖致心肌細胞凋亡的影響（±s，n=3）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　　細胞凋亡率/％莫諾苷　　馬錢苷空白組　0.000±0.000**　0.000±0.000**模型組　100.000±0.000　 100.000±0.000低劑量組　57.667±3.512*　59.667±5.508*中劑量組　45.000±3.606*　51.000±4.583*高劑量組　32.000±2.000*　37.000±2.646*

圖1　TUNEL染色法檢測糖尿病心肌細胞凋亡的影響

3.3 Western b1ot法檢測莫諾苷和馬錢苷對高糖致心肌細胞蛋白表達的影響 為了各組數據方便平行比較，實驗中將空白組中Caspase-3/β-ACTIN與Bc1-2/Bax的比值設定為1，其他高糖組與高中低劑量組數據按等比例轉換處理而得。由表3可知，心肌細胞經高糖造模后，與空白組比較Caspase-3/β-ACTIN值增加，有顯著性差異（P＜0.01）。馬錢苷與模型組比較，低劑量組Caspase-3/β-ACTIN減少，但不顯著（P＞0.05），中、高劑量組Caspase-3/β-ACTIN顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）；馬錢苷低劑量組Bc1-2/ Bax增加，但增加不顯著（P＞0.05），中、高劑量組Bc1-2/Bax顯著增加（P＜0.01）。

莫諾苷與模型組比較，低劑量組Caspase-3/β-ACTIN減少，但不顯著（P＞0.05），中、高劑量組Caspase-3/β-ACTIN顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）；莫諾苷低、中劑量組Bc1-2/Bax增加，但增加不顯著（P＞0.05），高劑量組Bc1-2/Bax顯著增加（P＜0.05）。

表3　W estern blot法檢測馬錢苷和莫諾苷對高糖致心肌細胞蛋白表達的影響（±s，n=3）

表3　W estern blot法檢測馬錢苷和莫諾苷對高糖致心肌細胞蛋白表達的影響（±s，n=3）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　Caspase-3/β-ACTIN　Bc1-2/Bax空白組　1.000±0.000**　1.000±0.000**模型組　3.092±1.322　0.105±0.067馬錢苷低劑量組　3.012±1.311　0.163±0.005馬錢苷中劑量組　2.405±0.903*　0.425±0.018**馬錢苷高劑量組　1.936±0.539**　0.516±0.061**莫諾苷低劑量組　2.920±1.273　0.134±0.046莫諾苷中劑量組　2.440±1.136*　0.218±0.056莫諾苷高劑量組　2.260±1.307**　0.343±0.020*

4 討論

糖尿病心肌病是糖尿病重要的并發癥之一，目前已明確刺激和促進糖尿病心肌病各種并發癥發作的重要因素是高血糖。糖尿病大鼠模型在大于16.6 mmo1/L的高血糖狀態下5～7 d即可出現特異性心肌病變［6］。故實驗體外培養乳大鼠原代心肌細胞建立高血糖模型，模擬人體糖尿病環境構建糖尿病性心肌細胞損傷模型，旨在觀察馬錢苷和莫諾苷對高糖誘導的心肌細胞的保護作用。本實驗中30 mmo1/L的葡萄糖作用心肌細胞24 h后，其凋亡率均增加，與空白組比較，差異顯著，說明本次實驗模型穩定可靠。糖尿病心肌病確切的發病機制尚不完全清楚，但導致其發病的根本原因大致為心肌細胞糖脂代謝異常、心肌細胞異常凋亡、胰島素抵抗和鈣穩態失衡，心肌纖維化以及心臟自主神經調節異常等。而其中心肌細胞的增殖和凋亡對糖尿病心肌病的病變發展起著重要的作用。在高血糖環境下，氧化應激增加導致信號轉導途徑改變，引起異常基因表達，能激活細胞的程序化死亡［7］，其機制可能為血糖濃度的升高導致胰島B細胞表面凋亡基因Bad、Bik、Bax、Bid的過度表達而抑制凋亡抑制基因Bc1-2的表達，從而誘導胰島B細胞的凋亡［8］。因此，能否促進心肌細胞增殖與抑制其凋亡成為治療糖尿病心肌病的關鍵。于是本實驗采用MTT法、TUNEL法和Western b1ot法對山茱萸的有效成分馬錢苷和莫諾苷對高糖致損傷的心肌細胞的增殖與凋亡的影響進行研究。

MTT法中馬錢苷和莫諾苷作用于糖尿病心肌細胞48 h 和72 h內，隨時間加長，促進心肌細胞增值越明顯，且心肌細胞也隨著馬錢苷、莫諾苷劑量增加，效果更明顯。TUNEL法染色之后，與模型組相比，馬錢苷和莫諾苷給藥組低、中、高劑量組均能降低心肌細胞的凋亡率，且與模型組比較有顯著差異，與MTT法結果一致，說明馬錢苷和莫諾苷具有抑制心肌細胞凋亡，具有保護心肌細胞的作用。本實驗Western b1ot法主要觀察高糖誘導的心肌細胞的Bc1-2、Bax和Caspase-3蛋白表達水平。其中，Bc1-2主要功能是促進細胞的生存，抑制細胞的凋亡［9］，Bax的增高則促進細胞凋亡。在正常細胞中Bc1-2與Bax-2二者相互協調以維持細胞的生存，故通過檢測二者的比值可推斷細胞凋亡的變化情況［10］。另外，Caspase-3是凋亡的核心，活化的Caspase-3能特異性地切割不同底物導致細胞凋亡。本實驗中馬錢苷、莫諾苷給藥組中，Bc1-2蛋白的表達明顯增加，Bax蛋白的表達降低，Caspase-3酶活性降低，使得Bc1-2/ Bax值增加，Caspase-3/β-ACTIN值降低，進而減少細胞的凋亡。日本學者Park C H［11］等研究馬錢苷對II型糖尿病db/db類小鼠肝中高血糖激活的信號通路的抵抗作用中，發現馬錢苷能通過增加蛋白Bc1-2的表達對抗II型糖尿病相關肝病的氧化應激反應，這與本實驗結果相似，說明馬錢苷、莫諾苷具有抑制細胞的凋亡，延長細胞壽命作用，改善其心功能。

3個實驗結果均一致表明山茱萸的有效成分馬錢苷和莫諾苷起到保護心肌細胞的作用，作用機制可能表現為啟動心肌細胞的增殖活性，改變氧化應激，調節Bc1-2、Bax 和Caspase-3蛋白的表達而抑制心肌細胞凋亡。因此，可以推測馬錢苷和莫諾苷在增強心臟功能，治療糖尿病心肌病上有巨大的潛力，有待作進一步開發研究。

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*通信作者：皮文霞（1968—），女，副教授，研究方向為中藥學。Te1：（025）85811512，E-mai1：piwenxia@163.com

作者簡介：趙文望（1990—），女，碩士生，研究方向為中藥學。Te1：18351895679，E-mai1：zhaowenwang100@sina.cn

基金項目：國家自然科學基金項目（81274056）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目（DE63063683）

收稿日期：2015-01-22

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.036

中圖分類號：R966

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）01-0160-04