肛門洗劑對肛瘺模型大鼠TGF-β1/p-Smad3/MMP-1信號通路蛋白的影響

謝昌營， 趙曉娟， 吳成成， 肖慧榮， 萬 玙， 黃海鵬

（江西中醫藥大學附屬醫院，江西南昌330006）

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肛門洗劑對肛瘺模型大鼠TGF-β1/p-Smad3/MMP-1信號通路蛋白的影響

謝昌營， 趙曉娟， 吳成成， 肖慧榮*， 萬 玙， 黃海鵬

（江西中醫藥大學附屬醫院，江西南昌330006）

摘要：目的 觀察肛門洗劑對肛瘺模型大鼠創面愈合率及轉化生長因子（TGF-β1）信號通路蛋白表達的影響。方法健康SD大鼠40只隨機抽取10只，為正常對照組；余下30只建立肛瘺模型后，隨機分為模型對照組、肛門洗劑組和陽性對照組。各組連續干預14 d。檢測實驗末各組大鼠TGF-β1信號通路相關蛋白及膠原蛋白co11agen I、co11agenⅢ表達水平。結果 與正常對照組相比，3組TGF-β1、p-Smad3、co11agen I、co11agenⅢ均上調，差異具有統計學意義（P＜0.05），且肛門洗劑組較模型對照組和陽性對照組的上調更為明顯（P＜0.05）。與正常對照組相比，3組基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）均下調，差異具有統計學意義（P＜0.05），且肛門洗劑組較模型對照組和陽性對照的組下調更為明顯（P＜0.05）。結論 肛門洗劑能激活TGF-β1信號通路，抑制MMP-1的表達，促進創面纖維形成，加速創面愈合，這可能是其治療肛瘺的重要機制之一。

關鍵詞：肛瘺；肛門洗劑；TGF-β1；p-Smad3；MMP-1

肛瘺是外科常見疾病，其不能自愈，不及時治療會反復形成肛周膿腫，目前治療方式多以手術切開為主，但術后創面愈合周期長是臨床多年來的治療難點。隨著醫學的發展，研究者們對肛瘺術后愈合的認識逐漸放到了轉化生長因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）細胞信號轉導通路上。TGF-β1是由多種細胞分泌的一類具有多重生物學效應的生長因子，在膠原代謝中發揮著重要橋梁的作用，參與了創面愈合、瘢痕形成的全過程［1］。屬于Smads家族的Smad3作為TGF-β1的下游因子，其磷酸化后能夠介導胞外刺激傳遞到核內，通過調控MMP-1的合成參與調節細胞外基質的動態平衡和組織纖維化［2］，進而對創面愈合產生重要影響。肛門洗劑是我院臨床治療肛瘺的有效中藥外用復方，本實驗通過復制肛瘺動物模型，同步檢測各組實驗大鼠TGF-β1信號通路蛋白的表達，探討TGF-β1信號通路與肛瘺的關系及從細胞信號轉導角度分析肛門洗劑治療肛瘺的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 清潔級健康SD大鼠40只，雌雄各半，體質量200～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證批號SCXK（湘）2013-0004。飼養1周以適應環境。

1.1.2 主要藥物與試劑 高錳酸鉀（濟南康福生制藥有限公司，140203）；肛門洗劑（江西中醫藥大學附屬醫院，20140401）；氯胺酮（福建古田藥業有限公司，KH140201）；TGF-β1抗體（美國Santa Cruz公司，SC-146）；p-Smad3抗體（美國CST中國分公司，#9520）；MMP-1抗體（美國Santa Cruz公司，SC-21731）；co11agen I抗體（美國Proteintech Group公司，14695-1-AP）；co11agenⅢ抗體（美國Proteintech Group公司，13548-1-AP）。

1.2 方法

1.2.1 分組 SD大鼠40只隨機抽取10只，為正常對照組，余下30只建立肛瘺模型，將建模成功的實驗大鼠隨機分為模型對照組、肛門洗劑組及陽性對照組。

1.2.2 肛瘺模型建立 參照王琛等［3］方法，采用綜合法制作肛瘺術后創面模型。術前對大鼠背部手術區域備皮，氯胺酮按100 mg/kg腹腔注射，麻醉后，在備皮區碘伏棉球常規消毒，距頸后2.5 cm處用創傷制作器在脊柱旁側0.5 cm處切割直徑約為1.8 cm的圓形創口，深達肌層，肌層傷口厚度約為0.3 cm，止血后在創面上加糞液1 mL，以油紗、敷料、膠帶固定，48 h去除覆蓋物，見傷口有膿性分泌物、有糞臭味者為造模成功。

1.2.3 給藥方法 肛門洗劑由五倍子、苦參、明礬、芒硝、桑寄生、荊芥、黃柏、白及組成，將上藥粉碎成粗粉，加水2 000 mL，浸泡15 min后武火煮沸，改文火再煎15 min，去渣存液，每150 mL為一包，使用時按1∶4稀釋后擦洗創面，紗布包扎，每天2次。陽性對照組使用高錳酸鉀，按1∶5 000稀釋后擦洗創面，紗布包扎，每天2次。模型對照組用等量生理鹽水擦洗創面，紗布包扎，每天2次。各組連續干預14 d。

1.3 樣本采集與檢測

1.3.1 創面愈合率 參照潘友珍等［4］方法測量創傷面積，并計算創面愈合率。愈合率=（原始創面面積-當前創面面積）/原始創面面積。

1.3.2 組織蛋白提取與檢測 取創面肉芽組織，置入液氮凍存。取適量凍存組織按照約1∶8（質量∶體積）的比例加入組織裂解液混合，勻漿后渦旋混勻，靜置1 h，18 000 rpm、4℃離心30 min，取上清，即為組織的總蛋白質，Bradford方法測定蛋白質濃度，分裝備用。采用Western b1ot法檢測目標蛋白，將50 μg肉芽組織總蛋白加入2× SDS上樣緩沖液，100℃變性8 min，上樣，恒定電流，前15 min 16 mA/ge1電泳，然后32 mA/ge1電泳至底部。轉膜，封閉2 h后加入一抗4℃雜交過夜，加入二抗后再次室溫雜交2 h，漂洗后ECL曝光顯像，掃描，保存，分析。

1.4 統計學方法 所有資料進行正態性檢驗，用SPSS 17.0統計分析軟件包進行處理，計量資料均采用±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，先進行方差齊性檢驗，方差齊時采用LSD法，方差不齊時采用Tamhane' T2法，顯著性水準a=0.05。

2 結果

2.1 創面愈合率 各組實驗大鼠創面愈合率見表1，顯示肛門洗劑組和陽性對照組的創面愈合率明顯優于模型對照組（P＜0.05），肛門洗劑組較陽性對照組，促進創面愈合效果更好（P＜0.05）。

表1　實驗后各組間創面愈合率（±s，％）

注：與模型對照組比較，▲P＜0.05；與陽性對照組比較，*P＜0.05

組別　　動物數　　創面愈合率正常對照組　10—模型對照組　10　15.25±2.82肛門洗劑組　10　68.96±10.52▲*陽性對照組　10　45.76±8.13▲

2.2 實驗后各組間TGF-β1、p-Smad3、MMP-1的表達 各組實驗大鼠TGF-β1、p-Smad3、MMP-1的表達見表2、圖1。表2顯示，創傷3組TGF-β1、p-Smad3均上調，與正常對照組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05），且肛門洗劑組較模型對照組和陽性對照組上調更為明顯（P＜0.05）。創傷3組MMP-1均下調，與正常對照組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05），且肛門洗劑組較模型對照組和陽性對照組下調更為明顯（P＜0.05）。

2.3 實驗后各組間co11agen I、co11agenⅢ的表達 實驗后各組實驗大鼠co11agen I、co11agenⅢ的表達見表3、圖2。表3顯示，創傷3組co11agen I、co11agenⅢ表達均上調，與正常對照組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05），且肛門洗劑組較模型對照組和陽性對照組上調更為明顯（P＜ 0.05）。

表2　實驗后各組間TGF-β1、p-Smad3、MMP-1的表達（±s）

表2　實驗后各組間TGF-β1、p-Smad3、MMP-1的表達（±s）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.05；與模型對照組比較，*P＜0.05；與陽性對照組比較，#P＜0.05

1　p-Smad3　MMP-1正常對照組組別動物數　TGF-β 10　 0.12±0.02　 0.11±0.03　0.87±0.13模型對照組10　 0.19±0.03▲　0.22±0.04▲　0.52±0.10▲肛門洗劑組10　 0.54±0.12▲*#0.61±0.10▲*#　0.29±0.05▲*#陽性對照組10　 0.37±0.06▲*0.41±0.05*　0.41±0.07▲*

注：由左至右依次為正常對照組、模型對照組、肛門洗劑組、陽性對照組圖1　實驗后各組間TGF-β1、p-Smad3、MMP-1的表達

表3　實驗后各組間collagen I、collagenⅢ的表達（±s）

表3　實驗后各組間collagen I、collagenⅢ的表達（±s）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.05；與模型對照組比較，*P＜0.05；與陽性對照組比較，#P＜0.05

組別　動物數　co11agen I　co11agenⅢ正常對照組10　0.12±0.01　0.14±0.02模型對照組　10　0.26±0.03▲　0.39±0.03▲肛門洗劑組　10　0.45±0.04▲*#　0.67±0.05▲*#陽性對照組　10　0.32±0.03▲*　0.37±0.03▲*

圖2　實驗后各組間collagen I、collagenⅢ的表達

3 討論

肛瘺是臨床常見的肛腸疾病，其發病率約為肛腸疾病總發病率的30％，合理的手術方式是治愈肛瘺的關鍵，但因術后創面多為開放性，同時由于支管殘腔眾多，故多存在術后愈合周期長等難以避免的治療難點［5］。肛瘺術后創面修復和愈合是一個復雜而漸進的動力學過程，它包括早期各種細胞的聚集和受損組織的清除、細胞的移動和增殖、局部產生大量膠原基質及最后瘢痕形成過程，而其中起主導作用的便是TGF-β信號通路介導的纖維形成階段［6］。TGF-β的3個亞型中，TGF-β1在創面愈合過程中的靈敏性和特異性較強，被認為與傷口愈合密切相關，能促進纖維化和瘢痕形成，同時，TGF-β1被公認為是最重要的成纖維細胞的強效趨化因子，是細胞外基質蛋白合成和降解的重要調節因素，它不僅能直接作用于成纖維細胞對基質的合成，而且是刺激肉芽組織形成的最有效的細胞因子［7］。在大鼠創傷模型中，TGF-β1是最早表明能加速創傷愈合的生長因子，局部應用TGF-β1的受體或中和抗體可延緩創面的修復過程［8］。進一步研究TGF-β1信號通路，發現Smad家族是最早被證實的TGF-β1受體激酶的底物，是負責將TGF-β1信號從細胞表面的受體傳遞至核內的關鍵信號分子，其中Smad3的羧基端可被TGF-β1磷酸化，而調控纖維形成的下游重要元件MMP-1的啟動區域存在Smad3結合元件，使得磷酸化的Smad3在轉位入核后可與之結合，從而直接作用于DNA，調節靶基因的轉錄，進而對創面愈合起到調控作用［9-10］。

肛門洗劑以清熱解毒消腫、燥濕止癢止血為其基本功效，該洗劑由五倍子、苦參、明礬、芒硝、桑寄生、荊芥、黃柏、白及組成。五倍子味酸、澀，性寒，可治各種出血及癰腫瘡癤。苦參味苦，性寒，《仁齋直指方》云：“治下部瘡漏：苦參煎湯，日日洗之。”兩者合而為君。明礬功效消痰，燥濕，止瀉，止血，善治口舌生瘡，瘡痔疥癬。芒硝潤燥軟堅，清火消腫。兩者合而為臣。桑寄生補肝腎、強筋骨，又治瘡毒。荊芥善破結聚氣，下瘀血，除濕痹，《簡便單方》中治痔漏腫痛云：“荊芥煮湯，日日洗之”。黃柏味苦，性寒，治瘡瘍腫毒。《神農本草經》云白及“主癰腫、惡瘡、敗疽，傷陰死肌，胃中邪氣”。諸藥合用，共奏清熱解毒、消腫燥濕之功。該中藥復方為江西中醫藥大學附屬醫院肛腸科以五倍子湯為基礎自擬的一種外科洗液，在臨床安全、有效地使用了十余年。前期研究證實了肛門洗劑對于肛瘺、痔等肛周疾病具有改善患者臨床癥狀、加速創面愈合的良好功效［11-12］。本研究中，與正常對照組比較，模型對照組實驗大鼠TGF-β1信號通路相關蛋白有所升高，說明機體已通過TGF-β1信號通路啟動了創傷修復程序，但經過肛門洗劑治療后，局部TGF-β1信號通路被明顯激活，能夠促進創面愈合的TGF-β1及p-Smad3蛋白表達較模型對照組顯著增高，而能夠水解細胞外基質的MMP-1蛋白則表達降低，同時，創面愈合過程中的重要修復纖維co11agen I、co11agenⅢ的表達亦較模型對照組顯著上調，且療效明顯優于陽性對照組。上述研究表明，相對于高錳酸鉀的單純殺菌作用，肛門洗劑除了具備清熱解毒、消腫燥濕的效應外，更可能通過對TGF-β1信號轉導通路進行干預性調節，從而抑制細胞外基質的降解，促進纖維的增殖，進而加速創面愈合，但具體機制尚需進一步研究。

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*通信作者：肖慧榮（1963—），男，主任醫師，從事肛腸外科臨床與實驗研究工作。E-mai1：jxszyygck@126.com

作者簡介：謝昌營（1984—），男，碩士，主治醫師，從事肛腸外科臨床與實驗研究工作。Emai1：xcyxcy85091@126.com

基金項目：江西省教育廳科學技術研究項目（GJJ14618）

收稿日期：2015-02-11

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.038

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）01-0167-03