刺五加注射液對慶大霉素耳中毒豚鼠耳蝸螺旋神經節中谷氨酸及其受體表達的影響

賈琳琳， 張 滌， 李佳明， 張 波， 徐 劍， 陶春虹， 李春雨

（1.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江佳木斯154007；2.佳木斯大學附屬第二醫院，黑龍江佳木斯154002；3.佳木斯市中心醫院，黑龍江佳木斯154002）

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刺五加注射液對慶大霉素耳中毒豚鼠耳蝸螺旋神經節中谷氨酸及其受體表達的影響

賈琳琳1， 張 滌2， 李佳明1， 張 波1， 徐 劍2， 陶春虹3， 李春雨1

（1.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江佳木斯154007；2.佳木斯大學附屬第二醫院，黑龍江佳木斯154002；3.佳木斯市中心醫院，黑龍江佳木斯154002）

摘要：目的 觀察刺五加注射液對慶大霉素耳中毒豚鼠耳蝸螺旋神經節細胞中谷氨酸及其受體表達的影響，并探討相關機制。方法 實驗動物隨機分成正常對照組、慶大霉素組、刺五加+慶大霉素組和刺五加注射液組。采用腹腔注射慶大霉素制作耳毒模型，刺五加注射液進行干預治療。連續用藥10 d后，觀察各組實驗動物聽閾變化、耳蝸螺旋神經節中谷氨酸及其受體表達情況。結果 與正常對照組和刺五加注射液組相比，慶大霉素組豚鼠聽閾閾值和耳蝸螺旋神經節中谷氨酸及其受體的表達明顯增高；刺五加注射液可顯著改善慶大霉素所致的聽閾改變和降低谷氨酸及其受體的表達。結論 慶大霉素作用下耳蝸螺旋神經節細胞中谷氨酸和其相應受體表達增高；刺五加注射液可通過抑制谷氨酸及其受體在耳蝸螺旋神經節中的過度表達，對螺旋神經節細胞起到保護作用。

關鍵詞：刺五加注射液；螺旋神經節；谷氨酸；受體；慶大霉素

谷氨酸是耳蝸內主要的興奮性傳入神經遞質，在內毛細胞與螺旋神經之間介導信號傳遞作用。在中樞神經系統中，在各種病理條件下，谷氨酸及其類似物的過度釋放和堆積可以產生興奮性毒性，但其參與氨基苷類抗生素（AmAn）耳毒性發生的相關機制尚未完全闡明。刺五加注射液為臨床上治療心腦血管疾病的常用藥物，我們前期工作發現刺五加注射液對外源性谷氨酸所致豚鼠耳蝸復合動作電位改變和內耳結構損傷具有拮抗作用［1］，本研究通過制作豚鼠慶大霉素耳中毒模型，觀察刺五加注射液對豚鼠耳蝸螺旋神經節中谷氨酸及其受體表達的影響，進一步探討刺五加注射液拮抗慶大霉素所致聽覺損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組處理 選用耳廓反應靈敏的健康白色紅目豚鼠40只，體質量為200～250 g，雌雄不拘，購自中國醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SYXK（遼）2007-0003。隨機分成正常對照組、慶大霉素組、刺五加+慶大霉素組和刺五加注射液組。慶大霉素組每日腹腔注射慶大霉素注射液100 mg/kg；刺五加+慶大霉素組每日腹腔注射刺五加注射液250 mg/kg和與慶大霉素組等量的慶大霉素注射液；正常對照組腹腔注射生理鹽水2.5 m L/kg；刺五加注射液組注射與刺五加注射液+慶大霉素組等量的刺五加注射液注射液［2-3］，連續用藥10 d。

1.2 主要藥物、試劑和儀器 硫酸慶大霉素（山東恩威藥業有限公司，批號150881507）；刺五加注射液（哈爾濱珍寶制藥有限公司，批號20110715）；免疫組化試劑盒、相關抗體和試劑購自武漢博士德生物工程有限公司；顯微圖像分析系統；電子分析天平；聽覺腦干反應（ABR）誘發記錄系統；解剖顯微鏡。

1.3 檢測ABR閾值 各組豚鼠分別于用藥前和停藥后第1天檢測ABR閾值。1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（40 mg/kg）。操作在隔音電屏蔽室內進行，采用主頻率為3 kHz的短聲刺激信號，具體操作方法參考相關文獻［1-2］。

1.4 SABC免疫組化法檢測谷氨酸、N-甲基-D-天冬氨酸型受體（NMDAR1）的表達 停藥第1天檢測ABR閾值后，將實驗動物快速斷頭處死取耳蝸制備標本［3］，參照即用型SABC免疫組化試劑盒使用說明書要求進行染色。應用顯微圖像分析技術，計算各組耳蝸螺旋神經節中谷氨酸及NMDAR1的陽性反應產物灰度值。

1.5 統計學分析 實驗數據采用SPSS 18.0統計軟件進行處理，數值以±s表示，各組間差異的顯著性比較用t檢驗，P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 ABR閾值檢測 結果（表1）顯示，用藥前各組豚鼠ABR閾值無明顯差異；連續腹腔注射藥物10 d后，慶大霉素組ABR閾值升高明顯，與正常對照組相比差異明顯；刺五加+慶大霉素組ABR閾值與慶大霉素組相比明顯減低，說明刺五加注射液對慶大霉素引起的聽力損傷有拮抗作用。

表1　豚鼠ABR閾值（dbnHL）變化（±s，n=10）

表1　豚鼠ABR閾值（dbnHL）變化（±s，n=10）

注：與用藥前比較，*P＜0.01；與正常對照組比較，#P＜0.01；與用藥后慶大霉素組比較##P＜0.01

組別　　用藥前　　用藥后正常對照組　2.55±2.05　2.55±2.05慶大霉素組　2.35±1.93　36.55±6.63*#刺五加+慶大霉素組　2.54±2.15　9.53±2.32##刺五加注射液組2.98±2.35　3.15±2.25

2.2 豚鼠耳蝸螺旋神經節中谷氨酸、NMDAR1的蛋白質表達 正常對照組、刺五加注射液組耳蝸螺旋神經節細胞中有谷氨酸和NMDAR1的表達；慶大霉素組螺旋神經節細胞有谷氨酸和NMDAR1的棕黃色顆粒沉著，與正常對照組相比，表達程度明顯增強；刺五加+慶大霉素組耳蝸螺旋神經節細胞中棕黃色顆粒的染色程度明顯淺于慶大霉素組。結果見表2、圖1、圖2。

表2　豚鼠耳蝸螺旋神經節中谷氨酸和NMDAR1陽性反應平均灰度值（±s，n=10）

表2　豚鼠耳蝸螺旋神經節中谷氨酸和NMDAR1陽性反應平均灰度值（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，#P＜0.01；與慶大霉素組比較，△P＜0.01

組別　　谷氨酸　NMDAR1正常對照組　115.24±6.45　95.63±6.24慶大霉素組　71.31±7.53#　66.35±6.74#刺五加+慶大霉素組　92.44±5.65△　86.53±7.36△刺五加注射液組112.06±5.85　93.74±5.31

圖1　谷氨酸在各組螺旋神經節細胞中的表達（×200）

3 討論

內毛細胞和螺旋神經節細胞之間的傳入神經突觸是聽覺傳導通路上的第一個突觸結構，在外界信號的傳入和編碼過程起著重要的作用。在聲信號傳導的過程中，螺旋神經節細胞接受毛細胞釋放的興奮性遞質谷氨酸的刺激產生興奮性電位，然而在缺血缺氧、噪音、耳毒性藥物等因素下所致過量的谷氨酸釋放及降解受阻會引起耳蝸螺旋神經節細胞的損傷［2，4 -5］。有研究表明，外源性谷氨酸耳蝸灌注可導致豚鼠耳蝸傳入神經元形態和功能的損害，預先灌流含有谷氨酸受體拮抗劑的人工外淋巴液可防止谷氨酸所致的聽力損失和耳蝸病理改變［6-8］。谷氨酸的神經毒性作用主要通過突觸后膜的促離子型受體起作用。NMDAR是谷氨酸離子型受體的一類，有3個亞單位，分別為NR1、NR2和NR3，其中NR1最為重要，是NMDAR必需的功能亞單位。谷氨酸濃度的不斷增加可過度激活NMDAR，引起該受體控制的Ca2 +通道病理性開放，Ca2 +大量內流，導致內毛細胞下的傳入神經細胞水腫甚至死亡［9-10］。慶大霉素是AmAn的一種，其耳毒性已被臨床和動物實驗廣為證實，本實驗結果顯示，慶大霉素作用下可使螺旋神經節細胞中谷氨酸和NMDAR1表達增加并伴有聽力損傷，提示谷氨酸和NMDAR1參與了慶大霉素對螺旋神經節細胞的損傷機制。

圖2　NMDAR1在各組螺旋神經節細胞中的表達（×200）

刺五加注射液是用傳統中藥刺五加的莖葉制成的滅菌溶液，其主要成分為總黃酮，是臨床常用藥物，特別用于治療缺血性心腦血管疾病［11］。大量研究證實刺五加注射液的藥理作用包括擴張血管、增加器官的血流量、促進和改善微循環、調節機體新陳代謝、減少組織耗氧量、提高組織對缺氧的耐受性和清除自由基等［12-13］。考慮到刺五加注射液的藥理作用及AmAn耳毒性的基本病因之一是內耳微循環障礙造成耳蝸缺血、缺氧、自由基產生增多而使耳蝸內的結構受到損傷，我們推測刺五加注射液可通過增加耳蝸的血液循環、改善內耳缺血缺氧狀態而減輕谷氨酸的毒性作用和減少NMDAR的過度激活，起到對螺旋神經節細胞的保護作用。我們前期工作研究顯示刺五加注射液可抑制慶大霉素所致誘生型一氧化氮合酶（iNOS）的過度表達［3］，iNOS可催化生成高于正常組織濃度的、具有自由基毒性作用的NO。谷氨酸與NO關系密切，谷氨酸及其受體的過度釋放可刺激NO的生成，進一步加重對螺旋神經節細胞的損傷。因此刺五加注射液對抗谷氨酸及其受體的過度激活所引起的螺旋神經節損傷可能是通過抑制iNOS的表達，降低NO的量來實現的。

綜上所述，刺五加注射液可通過降低谷氨酸及其相應受體NMDAR1在螺旋神經節細胞中的表達來實現其拮抗慶大霉素的耳毒作用，但確切機制還需進一步研究。

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作者簡介：賈琳琳（1975—），女，博士，副教授，研究方向為中藥抗氨基苷類抗生素耳毒性機制的研究。Te1：（0454）8618310，E-mai1：zhangshurui175@163.com

基金項目：黑龍江省教育廳項目（12521564）

收稿日期：2014-04-27

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.043

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）01-0181-03