超聲波輔助纖維素酶解法提取馬尾松花粉中的總黃酮

邵圣娟， 李 曉， 衛靜莉

（太原工業學院化學與化工系，山西太原030008）

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超聲波輔助纖維素酶解法提取馬尾松花粉中的總黃酮

邵圣娟， 李 曉， 衛靜莉

（太原工業學院化學與化工系，山西太原030008）

摘要：目的 采用超聲波輔助纖維素酶解法提取馬尾松花粉中的總黃酮，并優化工藝條件。方法 以馬尾松花粉中的總黃酮量為指標，通過考察纖維素酶質量分數、乙醇體積分數、料液比、超聲時間、超聲溫度等因素的影響，并采用正交試驗優化提取工藝參數。結果 最優提取工藝參數組合為纖維素酶質量分數0.2％，溶劑乙醇體積分數60％，液固比25∶1，超聲時間30 min，總黃酮含有量12.02 mg/g。結論 該方法不僅提取時間短，提取條件溫和，溶劑用量少，提取率高，提取成本低，而且減少了有機溶劑帶來的環境污染。

關鍵詞：馬尾松花粉；總黃酮；超聲提取；纖維素酶解

黃酮類化合物具有降血脂、降血糖、預防心血管疾病等作用，同時它還是一種天然的抗氧化劑，具有清除氧自由基、抗氧化、抗癌、增強機體免疫力的生理活性［1］，廣泛存在于自然界的某些植物中。現代醫學表明，每1 g松花粉中含有17.6 mg黃酮［2］，尤以油松、馬尾松花粉中黃酮類含有量較高。

目前，松花粉中黃酮類化合物常見的提取方法為有機溶劑浸提。李雪梅［2］等通過比較不同溶劑對松花粉中總黃酮的提取效果，發現乙醇為最佳溶劑，并考察了影響總黃酮提取的因素。隨著新技術在天然藥物提取中的應用與發展，對于該類物質的提取逐漸發展為超聲波輔助提取法［3-4］、微波輔助提取法［5-6］、超臨界萃取法［7］，而對于被細胞壁包裹的某些植物類黃酮物質，可以采用酶解法［8-9］。本實驗采用超聲波輔助纖維素酶解法，以乙醇水溶液為溶劑，對馬尾松花粉總黃酮的提取工藝條件進行研究，考察纖維素酶質量分數、乙醇體積分數、料液比、超聲時間、超聲溫度等單因素的影響，正交試驗優化得出最佳提取工藝參數，從而為其作為營養保健品、化妝品的開發研究提供理論基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 TU-1901紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；BL3-120A數控超聲波清洗儀（上海科導超聲儀器有限公司）；TGL20-B離心機（上海安亭科學儀器廠）；HH-1恒溫水浴鍋（金壇市雙捷試驗儀器廠）；FA2104電子分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

1.2 材料 天然未破壁云南馬尾松Pinusmassoniana Lamb.花粉（40目）。蘆丁標準品（純度＞98％，中國藥品生物制品檢定所）；纖維素酶（活性單位＞20 U/mg，天津市諾奧科技發展有限公司）。無水乙醇、NaOH、NaNO2、A1（NO3）3均為分析純。

2 實驗方法

2.1 馬尾松花粉總黃酮的測定方法

2.1.1 蘆丁標準溶液的制備 將蘆丁標準品于105℃下干燥至恒重，準確稱取10 mg，轉移至50 mL量瓶中，60％ （V/V）乙醇溶解，稀釋定容，得到0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液。

2.1.2 蘆丁標準曲線的測定 分別移取上述蘆丁標準溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，轉移至6支25 mL量瓶中，依次加入5％ NaNO2溶液1 m L，混勻，靜置6 min；10％ A1（NO3）3溶液1 mL，混勻，靜置6 min；10％NaOH溶液10 mL，去離子水定容至刻度，靜置15 min。以去離子水為空白，在510 nm波長處測定不同濃度溶液的吸光度［10］，對不同蘆丁質量濃度（C）和對應吸光度（A）作圖，線性回歸得到蘆丁標準曲線。

其中，Y為馬尾松花粉總黃酮含有量（mg/g）；C為粗提液的質量濃度（mg/mL）。由標準曲線計算得出，M是松花粉的質量（g）。

2.2 單因素提取試驗 以馬尾松花粉中總黃酮的含有量（Y）為指標，分別考察纖維素酶質量分數、液固比、乙醇體積分數、超聲時間、超聲溫度對馬尾松花粉中總黃酮提取效果的影響。以纖維素酶質量分數為例，具體實驗過程如下。

取松花粉3 g，以15∶1的液固比例加入到60％乙醇水溶液中，HAc-NaAc緩沖液調節溶液pH為5，分別加入占松花粉質量0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％的纖維素酶溶解，將燒瓶置于50℃水浴鍋中，恒溫水浴加熱90 min，再超聲提取（40 W、45℃）20 min后，沸水浴滅活5 min，得到粗提取液。真空抽濾，濾液離心，60％乙醇水溶液定容至50 mL量瓶中，按照亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法測定各粗提取液的吸光度（A）。然后，由標準曲線方程計算得出對應的總黃酮濃度（C），進而得出不同纖維素酶質量濃度下的總黃酮含有量（Y）。

2.3 正交試驗 在“2.2”項單因素試驗的基礎上，設計合適的正交試驗，對超聲波輔助纖維素酶解法提取馬尾松花粉總黃酮的工藝條件進行優化，并進行重復驗證實驗，以此確定最優的提取條件。

3 結果與討論

3.1 蘆丁標準曲線 對不同蘆丁質量濃度（mg/mL，C）和對應吸光度值（A）作圖，線性回歸得出蘆丁標準曲線方程為C=0.053 4A+0.001 3，r2=0.999 1，在0.000 0～0.020 0 mg/m L范圍內線性關系良好。

3.2 單因素提取試驗結果

3.2.1 纖維素酶質量分數對馬尾松花粉總黃酮提取的影響 采用液固比為15∶1的60％乙醇水溶液，在超聲功率40 W、溫度45℃、超聲時間20 min的條件下，分別考察0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％纖維素酶質量濃度對馬尾松花粉總黃酮提取的影響，結果見圖1。

圖1　纖維素酶質量分數對總黃酮提取的影響

由圖可知，隨著纖維素酶質量分數的提高，馬尾松花粉中總黃酮含有量先升后降，當纖維素酶用量占松花粉質量的0.2％時，酶解反應效率和馬尾松花粉中總黃酮提取率最高；當纖維素酶質量分數較低時，反應底物濃度相對較大，此時兩者的結合未達到飽和，酶解反應速度和酶質量分數成正比，故增大纖維素酶質量分數，酶解反應速度也隨之增大；當纖維素酶質量分數增大，直至反應底物被酶完全飽和時，酶解反應效率達到最高；若繼續增大，酶解反應速度不再增加，甚至會降低，可能是由于酶反應中間絡合物的抑制作用。因此，適宜的纖維素酶質量分數為0.1％～0.3％。

3.2.2 乙醇體積分數對馬尾松花粉總黃酮提取的影響 采用纖維素酶質量分數為0.2％、液固比為15∶1的乙醇水溶液，設定超聲功率40 W、溫度45℃、超聲時間20 min，分別考察30％、40％、50％、60％、70％乙醇對馬尾松花粉總黃酮提取的影響，結果見圖2。

圖2　乙醇體積分數對總黃酮提取的影響

由圖可知，馬尾松花粉中總黃酮提取率隨乙醇體積分數的增加而增大，當達到一定值后，提取率開始降低，表明當乙醇體積分數較低時，對黃酮類有效成分的溶解作用較小；隨著其增大，傳質推動力增加，其溶解作用將增大；但若乙醇體積分數太大，相應的醇溶性雜質也會增加，而且會對纖維素酶的活性產生抑制作用，從而降低了提取效果。因此，選擇乙醇溶液體積分數為40％～60％較為合適。

3.2.3 液固比對馬尾松花粉總黃酮提取的影響 采用60％乙醇水溶液和0.2％纖維素酶，設定超聲功率40 W、溫度45℃、超聲時間20 min，分別考察10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1液固比對馬尾松花粉總黃酮提取的影響，結果見圖3。

圖3　液固比對總黃酮提取的影響

由圖可知，馬尾松花粉總黃酮提取率隨液固比的增加而增大，這是因為溶劑量越大，有效成分從植物組織內溶解到溶劑中的濃度差就越大，越有利于有效成分的擴散傳質。但溶劑用量達到一定程度后，提取率增加緩慢。考慮到經濟性及實驗后處理過程，選擇液固比為15∶1～25∶1較為合理。

3.2.4 超聲溫度對馬尾松花粉總黃酮提取的影響 采用液固比為15∶1的60％乙醇水溶液和0.2％纖維素酶，設定超聲功率40 W，超聲時間20 min，分別測定40、45、50、55、60℃超聲溫度下對馬尾松花粉總黃酮提取的影響，結果見圖4。

圖4　超聲溫度對總黃酮提取的影響

由圖可知，超聲溫度對馬尾松花粉中總黃酮提取的影響不大，不同溫度條件下總黃酮的提取率接近，表明纖維素酶在40～60℃范圍內均有較好的酶解效果。因此，正交試驗將超聲溫度的影響因素排除在外，僅設定為50℃。

3.2.5 超聲時間對馬尾松花粉總黃酮提取的影響 采用液固比為15∶1的60％乙醇水溶液和0.2％纖維素酶，設定超聲功率為40 W，超聲溫度為50℃，分別測定0、10、20、30、40 min超聲時間對馬尾松花粉總黃酮提取的影響，結果見圖5。

圖5　超聲時間對總黃酮提取的影響

由圖可知，在一定超聲時間內，超聲波輔助提取有效提高了松花粉總黃酮的提取率。超聲波可以有效破壞馬尾松花粉的細胞壁，促進細胞內更多物質溶出，使總黃酮提取率增加。但是隨著時間延長，較多的雜質也相應溶出，導致黃酮類有效成分相對減少，也可能由于超聲作用時間過長，破壞了纖維素酶的結構，降低了酶的活性，使松花粉中總黃酮提取率又有所降低。因此，選擇超聲作用時間為20～40 min較為合理。

3.3 正交試驗 由“3.2.4”項下結果可知，超聲溫度對馬尾松花粉中總黃酮提取率的影響不大，纖維素酶在40～ 60℃范圍內均有較好的酶解效果。因此，僅需考察乙醇體積分數（A）、液固比（B）、纖維素酶質量分數（C）、超聲時間（D）4個因素的交叉影響作用。以單因素提取試驗結果為基礎，選擇L9（34）正交表進行正交試驗，優化馬尾松花粉總黃酮的提取工藝條件，見表1。

表1　L9（34）正交試驗因素水平

然后，以馬尾松花粉總黃酮含有量為指標，對正交試驗結果進行極差分析，見表2。

表2　L9（34）正交試驗設計結果

由表可知，在超聲波-纖維素酶解法提取馬尾松花粉總黃酮的條件下，各因素對松花粉總黃酮提取率的影響依次為乙醇體積分數＞纖維素酶質量分數＞超聲時間＞液固比，可見乙醇體積分數的影響程度最顯著，而液固比最不顯著，可視為誤差項。此外，方差分析結果顯示，乙醇體積分數、纖維素酶質量分數、超聲時間對松花粉總黃酮的提取都有顯著的影響（P＜0.05），但其程度存在差異，與極差分析結果一致。同時，A3（9.77）、B3（7.98）、C2（8.43）、D2（8.20）均數最大，得出最優提取條件為A3B3C2D2，即乙醇體積分數60％，液固比25∶1，酶質量分數0.20％，超聲時間30 min。

然后，按“2.3”項下方法，對正交試驗所得最優組合A3B3C2D2進行重復驗證實驗。結果，該條件下馬尾松花粉總黃酮含有量達到12.02 mg/g。

4 結論

本實驗利用超聲波輔助纖維素酶解法提取馬尾松花粉中的總黃酮，通過正交試驗考察了各因素對其影響程度，發現乙醇體積分數的影響最為顯著，隨著乙醇體積分數、纖維素酶質量分數、超聲時間的增加，總黃酮提取率達到最大值，最優提取工藝條件為乙醇體積分數60％，液固比25∶1，纖維素酶質量分數0.20％，超聲時間30 min，所得馬尾松花粉總黃酮含有量為12.02 mg/g。

總之，纖維素酶解和超聲波協同作用提取馬尾松花粉中的總黃酮與傳統提取方法相比，提取時間短，提取條件溫和，溶劑用量少，提取率高，而且在減少提取成本的同時，也減少了有機溶劑帶來的環境污染。

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作者簡介：邵圣娟（1987—），女，碩士，助教，研究方向為天然產物的提取分離。E-mai1：youyou121abc@126.com

基金項目：太原工業學院院級科學基金（2014LY03）

收稿日期：2015-02-15

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.050

中圖分類號：R284.2

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）01-0204-04