HPLC法同時測定當歸四逆湯中3種有效成分

陳 瑛， 付正豐， 方應權， 岳秀永

（重慶三峽醫藥高等?？茖W校藥學系，重慶404120）

?

HPLC法同時測定當歸四逆湯中3種有效成分

陳 瑛， 付正豐*， 方應權， 岳秀永

（重慶三峽醫藥高等專科學校藥學系，重慶404120）

摘要:目的 建立同時測定當歸四逆湯（當歸、桂枝、芍藥、通草等）中甘草苷、細辛脂素和桂皮醛含有量的高效液相色譜（HPLC）法。方法 分析采用Symmetry?Shie1d C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；0.05％磷酸溶液-乙腈為流動相，梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；檢測波長分別為甘草苷237 nm、細辛脂素和桂皮醛287 nm；柱溫35℃。結果 甘草苷、細辛脂素和桂皮醛分別在4.042～40.42 μg/mL、0.196 0～19.60 μg/mL和10.08～100.8 μg/mL范圍內線性關系良好（r≥0.999 8），平均回收率在96.7％～97.0％之間。結論 該方法專屬性強，準確可靠，可用于完善當歸四逆湯的質量標準。

關鍵詞:當歸四逆湯；甘草苷；細辛脂素；桂皮醛；高效液相色譜（HPLC）

KEY W 0RDS: Danggui Sini Decoction；1iquiritin；asarinin；cinnama1dehyde；high Performance 1iquid chromatograPhy（HPLC）

當歸四逆湯出自《傷寒論》，由當歸12 g，桂枝9 g，芍藥9 g，通草6 g，細辛3 g，炙甘草6 g，大棗8枚組成［1］，具有溫經散寒、養血通脈的作用，被公認為治療血虛寒厥證的代表方［2-3］。現代藥理研究顯示，其具有擴血管、抗凝、抗血栓等作用。目前，關于當歸四逆湯中有效成分的測定主要集中于阿魏酸、肉桂酸、芍藥苷、甘草酸等［4-5］，本實驗采用高效液相色譜（HPLC）法，同時測定當歸四逆湯中甘草苷、細辛脂素和桂皮醛的含有量，可為完善其質量標準提供參考。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀，配有二元泵、自動進樣器、可變波長紫外檢測器、島津LC-So1ution色譜工作站（日本島津公司）；FW177中藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；Mi11iPore-Q超純水儀（美國Mi11iPore公司）；KQ-400KDB超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；賽多利斯R200D電子天平（德國賽多利斯公司）。

當歸四逆湯各味藥材均購自重慶市綦江縣藥材公司，經三峽中藥研究所付紹智教授鑒定，符合中國藥典（2010版）的規定。對照品均購自中國食品藥品檢定研究院，分別為甘草苷（批號140857-200411）、細辛脂素（批號141023-200516）、桂皮醛（批號141221-200405）。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Symmetry?Shie1d C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），采用波長切換方式，即237 nm（0～15 min）、287 nm（15～45 min）；柱溫35℃；流動相0.05％磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～15 min，20％B；15～45 min，20～48％ B）；體積流量1.0 mL/min；進樣量20 μL。理論塔板數按甘草苷、細辛脂素和桂皮醛計，均不低于4 000。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取甘草苷、細辛脂素和桂皮醛對照品適量，加甲醇配制成對照品貯備液，分別含甘草苷2.021 mg/mL、細辛脂素0.392 mg/mL和桂皮醛2.016 mg/mL。精密吸取上述對照品溶液適量，置于同一量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品貯備溶液，含甘草苷404.2 μg/mL、細辛脂素19.60 μg/mL和桂皮醛1 008 μg/mL。然后，精密吸取混合對照品貯備液適量，加甲醇稀釋20倍，即得。

2.2.2 供試品溶液 除大棗外，按處方比例稱取當歸等6味藥材，粉碎，過3號篩，按處方1/8的的量精密稱取粉末，加粉碎過的大棗1枚，最終平均質量約為11.6 g。置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇200 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（250 W、40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性供試品溶液 按“2.2.2”項下方法，分別制備缺炙甘草、細辛、桂枝的陰性供試品溶液。

2.3 方法專屬性 精密吸取上述混合對照品、供試品以及陰性供試品溶液適量，在“2.1”項條件下進行分析，記錄色譜圖，結果見圖1。由圖可知，甘草苷、細辛脂素和桂皮醛在各自對應的位置無干擾，表明該方法專屬性良好。

1.甘草苷 2.細辛脂素 3.桂皮醛1.1iquiritin 2.asarinin 3.cinnama1dehyde圖1　高效液相色譜圖Flg.1 HPLC chrom atogram s

2.4 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品貯備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，進樣分析。以峰面積Y對進樣濃度X（μg/mL）進行線性回歸，得甘草苷、細辛脂素和桂皮醛的回歸方程、相關系數（r）和線性范圍，結果見表1。

表1　3種成分的線性關系Tab.1 L lnear relatlonshlps of three constltuents

2.5 精密度試驗 分別取“2.2.1”項下混合對照品溶液，連續進樣6次，按上述色譜條件測定甘草苷、細辛脂素、桂皮醛的峰面積。結果顯示，其RSD值分別為1.7％、1.3％和0.95％，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 根據處方比例精密稱取各藥材，制備供試品溶液，室溫下放置，按上述色譜條件分別于0、2、4、6、8、10 h進樣，測定甘草苷、細辛脂素和桂皮醛峰的峰面積。結果顯示，其RSD值分別為1.7％、1.8％和1.2％，表明溶液在室溫下10 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗 根據處方比例精密稱取各藥材，共6份，制備供試品溶液，按上述色譜條件測定甘草苷、細辛脂素和桂皮醛的峰面積。結果顯示，其RSD分別為1.3％、1.6％、1.1％，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收試驗 精密稱取含有量已知（甘草苷0.322 mg/g、細辛脂素0.016 2 mg/g、桂皮醛1.01 mg/g）的供試品6份，每份5.8 g，加混合對照品溶液5 mL，按“2.3”項下方法制備，代入標準曲線計算各組分的含有量，結果見表2。

2.9 樣品測定 取3批供試品，按上述方法制備供試品溶液，測定并計算含有量，結果見表3。

表2　加樣回收試驗結果Tab.2 Results of recovery tests

表3　樣品測定結果（n=3）Tab.3 Determ lnatlon results of sam ples（n=3）

3 討論

3.1 供試品提取方法 根據文獻［6-8］，本實驗考察了提取溶劑的種類和提取方法，分別比較了甲醇、100％乙醇和70％乙醇，發現以甲醇為溶劑的提取效果最好。同時，比較了回流和超聲提取方法，發現兩者無顯著性差異，但后者簡便、節能，因此選擇超聲提取。另外，還比較了不同超聲功率和提取時間，最終確定功率250 W，頻率40 kHz，超聲處理30 min。

3.2 色譜條件的優化 為保證被測組分有良好的分離度和適當的保留時間，參照文獻［4，9-10］方法，考察了不同的流動相的組成、比例及洗脫方案，發現乙腈的分離效果好于甲醇，而且甘草苷等3種被測物質在偏酸性條件下的分離理論板數較好，最終確定以0.05％磷酸-乙腈為流動相。由于中藥復方所含成分較多，故本實驗采用梯度洗脫，可使被測物質和雜質得到良好的分離。另外，根據3種化合物紫外吸收波長的差別，甘草苷在237 nm波長處均有明顯吸收［11］，而細辛脂素和桂皮醛在287 nm附近有較強的紫外吸收［12-13］，并且雜質干擾少。因此，參考文獻［14-15］報道的方法，結合檢測組分的保留時間，采用波長切換法相應地設置檢測波長。

參考文獻:

［1］ 高宇勤，趙國平，汪仁望.當歸四逆湯中阿魏酸在大鼠血清中含量測定及藥動學研究［J］.中成藥，2011，33（3）: 419-422.

［2］ 劉 赟.基于“方-基本-體質”模式的當歸四逆湯方證研究［D］.廣州:廣州中醫藥大學，2014.

［3］ 熊 輝.當歸四逆湯的現代藥理與臨床應用分析［J］.中國醫藥指南，2014，5（12）: 301-302.

［4］ 高宇勤，趙 國，江仁望.當歸四逆湯中阿魏酸在大鼠血清中含量測定及藥動學研究［J］.中成藥，2011，33（3）: 419-422.

［5］ 趙 欣，谷 艷，宋欣鑫，等.HPLC法同時測定當歸四逆湯中4種有效成分的含量［J］.沈陽藥科大學學報，2008，25（3）: 200-203.

［6］ 陳良慧，單進軍，謝 彤，等.LC-MS/MS法測定復方祖師麻提取物中8種成分溶出影響［J］.中成藥，2014，36 （5）: 965-969.

［7］ 宋雙紅，色林格，陳 蓓，等.HPLC法測定4種細辛中馬兜鈴酸Ⅰ和細辛脂素［J］.中成藥，2014，36（8）: 1711-1715.

［8］ 于 艷，張立德，田 原，等.HPLC波長切換法同時測定桂枝茯苓丸中4種成分［J］.中成藥，2013，35（11）: 2426-2429.

［9］ 錢永健，張 超.HPLC法測定出血熱預防片中的女貞苷、特女貞苷、哈巴苷和哈巴俄苷［J］.中成藥，2015，37（1）: 116-120.

［10］ 劉書芬，梁倩倩，陳 巖，等.HPLC法同時測定防己黃芪湯中5種成分［J］.中成藥，2014，36（11）: 2312-2315.

［11］ 易 偉，狄留慶，李俊松，等.HPLC同時測定復方祖師麻片中8種有效成分的含量［J］.南京中醫藥大學學報，2015，31（1）: 74-76.

［12］ 高 森，李正翔，王志濤，等.九龍化風丸中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、羌活醇、異歐前胡素和細辛脂素的HPLC梯度洗脫法測定［J］.中成藥，2014，36（3）: 541-547.

［13］ 張麗珍，周之榮.高效液相色譜法測定四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷的含量［J］.醫藥導報，2014，33（12）: 1627-1630.

［14］ 張 梅，任愛農，楊玉蘭，等.HPLC波長切換法同時測定清清顆粒中9個成分的含量［J］.藥物分析雜志，2015，35（1）: 29-33.

［15］ 季寧平，徐曉秋，傅超美，等.HPLC法同時測定艾附暖宮丸中芍藥苷、阿魏酸和川續斷皂苷Ⅵ［J］.中成藥，2015，37（3）: 534-537.

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.020

Slmultaneous determ lnatlon of three effectlve com ponents ln Danggul Slnl Decoctlon

CHEN Ying， FU Zheng-feng*， FANG Ying-quan， YUE Xiu-yong
（DePartment of Pharmacy，Chongqing Three-Gorge Medical College，Chongqing 404120，China）

ABSTRACT:AIM To deve1oP an HPLC method for the simu1taneous determination of 1iquiritin，asarinin and cinnama1dehyde in Danggui Sini Decoction（Angelicae sinensis Radix，Cinnamomi Cassiae Ramulus，Paeoniae Lactilorae Radix and TetraPanacis PaPyriferi Medulla，etc.）. M ETH 0 DS Symmetry?Shie1d C18co1umn （250 mm×4.6 mm，5.0 μm）maintained at 35℃was used with 0.05％PhosPhoric acid-acetonitri1e asmobi1e Phase at a f1ow rate of1.0 mL/min in a gradiente1ution manner.The detection wave1engthswere setat223 nm for 1iquiritin，and 287 nm for asarinin and cinnama1dehyde.RESULTS Liquiritin，asarinin and cinnama1dehyde dis-P1ayed good 1inear re1ationshiPswithin the ranges of4.042 -40.42 μg/mL，0.196 0 -19.60 μg/mL and 10.08 -100.8 μg/mL（r≥0.999 8），resPective1y，with the average recoveries of 96.7％ -97.0％.C0NCLUSI0 N With good sPecificity，accuracy and re1iabi1ity，thismethod can he1P to imProve the qua1ity standard for Danggui Sini Decoction.

中圖分類號:book=326,ebook=104 R927.2

文獻標志碼:A

文章編號:1001-1528（2016）02-0325-04

*通信作者:付正豐（1978—），男，碩士，講師，主要從事中草藥資源開發與應用研究。Te1: 13996539870，E-mai1: 862120258@ qq.com

作者簡介:陳 瑛（1964—），女，副教授，主要從事有機化學的研究。Te1: 13594468289

基金項目:重慶市衛生計劃委中醫藥科技項目（2011-2-15）

收稿日期:2015-05-13

網絡出版日期: 2015-06-15

網絡出版地址: httP://www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20150615.1344.001.htm1