西黃丸對乳腺荷瘤小鼠外周血和腫瘤組織VEGF、MMP9表達的影響

任征遠， 馬 杰， 王一堯， 焦 戰， 曾常茜， 高文斌， 梁文波*

（1.大連大學醫學院，遼寧大連116622；2湖北醫藥學院，湖北十堰442000；3大連大學附屬中山醫院，遼寧大連116000）

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西黃丸對乳腺荷瘤小鼠外周血和腫瘤組織VEGF、MMP9表達的影響

任征遠1， 馬 杰2， 王一堯1， 焦 戰1， 曾常茜1， 高文斌3， 梁文波1*

（1.大連大學醫學院，遼寧大連116622；2湖北醫藥學院，湖北十堰442000；3大連大學附屬中山醫院，遼寧大連116000）

摘要:目的 通過檢測西黃丸對乳腺荷瘤小鼠外周血和腫瘤組織中血管內皮生長因子（VEGF）、基質金屬蛋白酶9 （MMP9）表達的影響，探討西黃丸對形成腫瘤微環境炎性相關因子調控作用。方法小鼠隨機分為6組建立荷瘤小鼠模型。藥物治療14 d后，取外周血，取瘤稱重，計算抑瘤率；用蛋白質免疫印跡和酶聯免疫法分別檢測乳腺荷瘤小鼠腫瘤組織和外周血中血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶9表達水平。結果 西黃丸高劑量組抑瘤率31.49％；西黃丸各組在外周血、腫瘤組織中血管內皮生長因子、金屬基質蛋白酶9表達量均低于模型對照組，其中西黃丸高劑量組與模型對照組相比較作用明顯（P＜0.05）。結論 西黃丸能夠抑制乳腺荷瘤小鼠炎性相關因子的表達，改變腫瘤微環境，具有逆轉免疫逃逸的趨勢。

關鍵詞:西黃丸；炎性相關因子；血管內皮生長因子；金屬基質蛋白酶9

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.047

西黃丸作為抗腫瘤的中成藥已流傳幾百年，臨床主要用于各種癌癥的治療及輔助治療，改善中晚期癌癥患者的臨床癥狀，提高生活質量。本課題組前期研究表明西黃丸可通過調節荷瘤鼠機體免疫及炎性相關因子TGF-β（轉化生長因子-β）、IFN-γ（干擾素-γ）、IL-2（白介素-2）、IL-6（白介素-6）、IL-8（白介素-8）等的表達提高機體免疫功能，發揮抗腫瘤的作用［1-2］，但對其調節腫瘤微環境相關炎癥因子VEGF、MMP9以及對腫瘤炎性微環境的作用尚未系統研究。本研究采用體內動物實驗方法，結合腫瘤免疫編輯理論，探討西黃丸對形成腫瘤微環境中炎性相關因子調控作用，以及改善腫瘤微環境和逆轉免疫逃逸作用的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與動物 小鼠乳腺癌細胞株（4T1）源自中國科學院細胞庫。清潔級雌性BALB/C小鼠，體質量18～22 g，60只，均購自大連醫科大學動物實驗中心，合格證號: SCKK（遼）2008-0002。

1.2 主要儀器 酶標儀ELX800產自于美國BioTek公司；美國Bio-Rid生產的基礎電泳儀、電泳槽、轉膜槽；美國Biorad chemidoc xRS +核酸蛋白分子凝膠成像系統。

1.3 主要試劑 上海朗頓生物技術有限公司生產的ELISA （VEGF、MMP9）試劑盒；ANTI-VEGF antibody ab9570、ANTI-MMP9 antibody ab38898購于上海艾博抗貿易有限公司，辣根酶標記山羊抗兔1gG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4 試驗藥物 北京同仁堂制藥廠所制的西黃丸，每瓶含有量3 g，每20粒質量為1 g，批準文號:國藥準字Z1040991。由浙江普洛康裕天然藥物有限公司生產的每片含有量0.1 g香菇多糖片，批準文號:國藥準字Z120501。依據人鼠劑量換算公式（參考徐叔云教授主編的《藥理實驗方法學》: db=da×（rb/ra）×（wa-3/w-3b），其中a為人，b為鼠，d為人的給藥劑量，r為鼠的表面積參數，w為體質量；運用劑量公式要求給藥劑量分別為正常劑量的2倍、5倍）求得西黃丸正常劑量、2倍劑量、5倍劑量分別為0.39、0.78、1.95 g/kg；香菇多糖為0.045 g/kg；依次稱取西黃丸0.98、1.95、4.88 g；香菇多糖片0.23 g，碾碎，分別加入蒸餾水，使其充分溶解，定容至28 mL，4℃保存備用。

1.5 模型建立與分組給藥 小鼠乳腺癌細胞株（4T1）經培養和胰蛋白酶消化處理后，收集細胞。將細胞用PBS調整為2×106/mL待用。隨機分成6組的60只BALB/c小鼠，抽取1組作為正常組，不作處理；其余小鼠右腋下碘伏消毒，抽取上述細胞0.1 mL（2×105個）分別接種于其他小鼠右腋內側皮下，完成荷瘤小鼠模型的建立。自建模后的第2日開始，按照每天2次，每10 g體質量0.2 m L，連續灌胃給藥14 d。模型對照組和正常組給予等體積的蒸餾水。

1.6 小鼠抑瘤率的測定 末次給藥后小鼠禁食12 h，小鼠眼球取血后斷頸處死，鈍性剝離瘤組織，取瘤稱質量，計算腫瘤抑瘤率。腫瘤抑瘤率（％）=（模型對照組平均瘤質量-治療后平均瘤質量）/模型對照組平均瘤質量×100％。

1.7 酶聯免疫(ELISA)法檢測乳腺癌荷瘤小鼠外周血中VEGF、MMMP9表達水平 取小鼠血液0.5 mL置放于37℃水浴箱中水浴充分收縮后，分離血清，采用ELISA法檢測各組小鼠血清中VEGF、MMP9的水平，依照試劑盒說明書的實驗步驟進行操作。用酶標儀在波長450 nm處測定D（光密度）值，隨后繪制標準曲線，依據VEGF和MMP9的量計算結果進行數據分析。

1.8 蛋白質免疫印跡(Western b1ot)法檢測乳腺荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF、MMP9表達水平 取20 mg腫瘤組織在液氮中粉碎，RIPA裂解液裂解蛋白提取上清液；各樣本取20 μL上清液做蛋白定量分析比較；80 μg樣品蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳（5％濃縮膠80 V，10％分離膠150 V）；300 mA分別轉膜45 min（VEGF）、95 min（MMP9）；TBST漂洗3次，每次10 min，轉膜后的聚偏氟乙烯（PVDF）膜用TBST溶解的10％牛血清蛋白封閉過夜；PVDF膜用TBST漂洗3次，每次10 min，TBST溶解的5％牛血清蛋白分別與一抗（1 000: 1 MMP9、2 500: 1 VEGF）孵育2 h或過夜；PVDF膜用TBST漂洗3次，每次10 min，TBST與羊抗兔二抗5 000: 1孵育二抗2 h，漂洗3次，每次10 min，PVDF膜ECL染色，Biorad chemidoc xRS +核酸蛋白分子凝膠成像系統顯像曝光，用ImageJ軟件對Western b1ot的結果圖像進行處理，計算各樣本的灰度值。

2 結果

2.1 西黃丸對乳腺荷瘤小鼠腫瘤生長的作用 西黃丸對乳腺荷瘤小鼠的腫瘤具有明顯抑制作用，其中高劑量組抑瘤率31.49％，模型對照組與高劑量組平均瘤重的組間差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1　西黃丸對不同劑量乳腺荷瘤小鼠腫瘤生長的作用（±s，n=10）

表1　西黃丸對不同劑量乳腺荷瘤小鼠腫瘤生長的作用（±s，n=10）

注:與模型對照組比較，△P＜0.05

組別　　劑量/（g·kg-1）　瘤質量/g　抑瘤率/％模型對照　　—　0.31±0.13　　—陽性藥物　0.045　 0.27±0.08　 11.04西黃丸低劑量組　0.390　 0.28±0.03　9.42西黃丸中劑量組　0.780　 0.26±0.07　 15.58西黃丸高劑量組　1.950　 0.21±0.06△31.49

2.2 西黃丸對乳腺荷瘤小鼠外周血VEGF、MMP9表達量的作用 在乳腺荷瘤小鼠外周血中VEGF、MMP9表達上，西黃丸各劑量組含有量均低于模型對照組。在外周血中VEGF表達量上西黃丸各劑量組與模型對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；其中正常對照組與西黃丸高劑量組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），陽性藥物

（香菇多糖）組與西黃丸高劑量組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。西黃丸高劑量組與模型對照組比較，外周血中MMP9表達量的差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2　西黃丸對乳腺荷瘤小鼠外周血中V EGF、MMP 9表達量的作用（±s，n=10）

表2　西黃丸對乳腺荷瘤小鼠外周血中V EGF、MMP 9表達量的作用（±s，n=10）

注:與模型對照組比較，△P＜0.05；與陽性藥物組比較，*P＜0.05

組別　　劑量/ （g·kg-1）VEGF/ （ng·L-1）MMP9/ （ng·L-1）正常對照　　—　269±50.1△　301±63.3模型對照　　—　405±32.8　 394±69.9陽性藥物　0.045　 345±55.3△　319±89.7西黃丸低劑量組　0.390　 339±29.4△　353±33.9西黃丸中劑量組　0.780　 334±20.1△　321±28.5西黃丸高劑量組　1.950　 290±64.1△*　311±32.6△

2.3 西黃丸對荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF、MMP9表達影響 從實驗結果看，西黃丸高、中、低劑量組在小鼠腫瘤組織中的MMP9和VEGF表達量上，明顯低于模型對照組。模型對照組與西黃丸各劑量組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05），陽性藥物組明顯高于西黃丸中、高劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05），而西黃丸低劑量組和陽性藥物組之間及西黃丸高劑量組與中劑量組之間，差異無統計學意義。見圖1和表3。

注: 1.模型對照組；2.陽性藥物；3.西黃丸低劑量組；4.西黃丸中劑量組；5.西量黃丸高劑量組圖1　We r s t e r nb l o t檢測

表3　西黃丸對荷瘤小鼠腫瘤組織VEGF、MMP 9灰度值的影響（±s，n=10）

表3　西黃丸對荷瘤小鼠腫瘤組織VEGF、MMP 9灰度值的影響（±s，n=10）

注:與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與陽性藥物組比較，*P＜0.05

組別　VEGF　MMP9模型對照　36 176±5 813　28 198±5 316陽性藥物　23 764±5 719△　19 753±5 458△西黃丸低劑量組　22 673±5 345△　20 742±5 743△西黃丸中劑量組　15 993±4 700△△*　11 471±5 083△△*西黃丸高劑量組　10 282±5 108△△*　8 975±5 216△△*

3 討論

西黃丸是由麝香、牛黃、沒藥（醋制）、乳香（醋制）4味名貴中藥組成，有著清熱解毒、合營消腫的藥性，現今臨床上對于癌癥的治療和輔助治療應用廣泛，其具有抗腫瘤，減少放化療的毒副作用，改善微循環，提高免疫力，鎮痛消炎等功效。研究表明牛黃能促進巨噬細胞功能，提高機體免疫力，有助于控制腫瘤發展［3］。麝香具有較強的抗炎，鎮痛作用，能夠抑制荷瘤小鼠腫瘤生長延長生存期，具有一定的免疫調節作用［4］；麝香酮有抗腫瘤新生血管形成的作用［5］。體外實驗表明乳香揮發油對多種腫瘤細胞的生長有抑制作用。沒藥的各種劑型都有良好的化瘀消腫作用［6］。

免疫編輯理論認為腫瘤的發生發展一方面取決于腫瘤細胞本身，還取決于腫瘤細胞所處的微環境，生存的土壤［7］。腫瘤微環境是正常組織和相鄰腫瘤細胞之間的部位，其組成包括腫瘤基質細胞，可溶性分子和細胞外基質［8］。腫瘤起始細胞賴以生長的支架和屏障由腫瘤微環境構建［9］。在腫瘤微環境中，由于缺氧和炎癥，間質細胞會被腫瘤細胞轉化，產生大量的炎性相關因子、生長因子、基質降解酶、及細胞趨化因子，包括IL-6、TGF-β、IL-10、MMP9、COX-2（環氧化酶-2）、VEGF等，通過孕育腫瘤干細胞、誘生新生血管和抑制免疫反應等方式促進腫瘤發展。IL-6、IL-10、TGF-β等抑制性炎性因子，可誘導產生抑制性T細胞等一系列抑制性細胞，在腫瘤周圍形成一免疫抑制的又是炎癥的微環境［10］。免疫抑制的炎性微環境的形成，會造成機體內腫瘤識別細胞及殺傷細胞的功能降低或無能，炎癥的微環境促進炎癥抑制性因子產生，進而加重免疫抑制。研究證明在炎癥和免疫抑制因子作用下，MMP9它以酶原的形式分泌，被激活后，形成Ⅳ膠原酶，破壞、降解靠近腫瘤表面的細胞外基質中的V型、Ⅳ型膠原和明膠。然后腫瘤細胞在缺失的基底膜的基礎上向周圍組織浸潤，最終導致腫瘤的侵襲和轉移［11］。同樣在炎癥和缺氧的微環境下，VEGF通過促進內皮細胞和基質細胞的轉移，抑制內皮細胞的凋亡，在腫瘤血管新生中起重要作用，同時能夠誘導促進淋巴管的形成。腫瘤血管生成主要需要內皮移行增殖和內皮移行通道形成，內皮移行增殖主要是由VEGF因子參與執行。內皮移行通道形成主要由基質金屬蛋白酶（MMPs）介導，MMP9參與水解血管與腫瘤之間基質，為內皮細胞移行打下基礎。有研究表明，由原發腫瘤細胞分泌的血管內皮生長因子VEGF在內皮細胞和巨噬細胞誘導特殊MMP9表達，后者通過VEGF受體酪氨酸激酶導致腫瘤新干細胞形成［12］。腫瘤的轉移和免疫抑制都與腫瘤周圍的炎癥和缺氧微環境密切相關，對這些炎性相關因子的調節，不是單純由宿主的相關細胞或者腫瘤細胞進行簡單的調節，而是由機體的TAM（腫瘤相關巨噬細胞）、DC（樹突細胞）、Treg（調節性T細胞）、MDSC（髓源抑制性細胞）等和腫瘤細胞、腫瘤干細胞和被腫瘤細胞轉化的機體細胞等共同參與的非常復雜的調節過程，同時炎性因子與這些細胞之間通過復雜的正反饋和負反饋的關系相互影響。腫瘤微環境中缺氧和過激的炎癥反應引起TAM、DC功能轉變和MDSC、Treg高表達和趨化，以及腫瘤細胞和腫瘤干細胞活性增強，使抑制性因子大量產生，最終導致腫瘤免疫抑制和逃逸。

楊偉［1］等研究西黃丸對乳腺癌荷瘤大鼠IL-6、TGF-β、IL-10的調節作用，證明西黃丸明顯降低乳腺癌荷瘤大鼠機體內抑制性因子IL-6、IL-10、TGF-β的表達水平，同時提高IL-2和IFN-γ表達。本試驗結果顯示，西黃丸可以明顯降低VEGF、MMP9在乳腺癌荷瘤小鼠的外周血及腫瘤組織內的表達水平，表明西黃丸能夠減少腫瘤微環境中相關的炎性因子，進而能夠弱化或逆轉腫瘤微環境的免疫抑制，提高乳腺癌荷瘤小鼠機體的抗腫瘤的免疫功能，起到抑瘤，降低腫瘤免疫逃逸的作用。其作用機制可能是西黃丸通過抗血小板聚集和抗凝血酶活性及降低纖維蛋白原水平，改善微循環的高凝狀態促進血液流動，同時微循環血管開放數量增加提高了攜氧能力，并增加了對組織的氧氣釋放量和加快酸性物質例如乳酸的排放，降低炎性組織內前列腺素E2（PGE2）水平，影響花生四烯酸代謝，降低白三烯等炎性物質生成，抑制中性粒細胞的炎性物質釋放；抑制NO產生和過氧化，抑制溶酶體的釋放酶；抑制炎性組織過氧化作用［13-18］，從而阻斷腫瘤組織微環境的缺氧反應機制，逆轉腫瘤組織的缺氧和抑制腫瘤微環境的過激炎癥反應。腫瘤組織微環境的缺氧及過激炎癥反應的改變和西黃丸通過其他未明的調節方式，使TAM、DC等免疫細胞的功能恢復或向抑瘤方向轉變；降低MDSC、Treg表達和趨化；以及西黃丸自身對腫瘤細胞的殺傷作用，同時提高細胞毒細胞、活性T細胞等腫瘤殺傷細胞活性，進而使IL-6、IL-10、TGF-β、MMP9、VEGF等因子表達明顯降低，提高IL-2、IFN-γ因子表達水平，最終形成逆轉腫瘤免疫逃逸的趨勢。

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*通信作者:梁文波（1962—），教授，博士，從事天然藥物活性成分的分離鑒定和成分分析研究。Te1:（0411）87403409，E-mai1: d11-wb@126.com

作者簡介:任征遠（1974—），男，碩士生，從事臨床腫瘤及腫瘤的中藥治療及機制研究。E-mai1: rzy4622@sohu.com

基金項目:大連金州新區科技計劃（2012-A1-046）

收稿日期:2014-12-21

中圖分類號:R285.5

文獻標志碼:B

文章編號:1001-1528（2016）02-0440-04