卵胞漿內單精子注射的精子優選技術的研究進展

李潔，鄭娟，周黎明

(寧波市婦女兒童醫院，寧波　315012)

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卵胞漿內單精子注射的精子優選技術的研究進展

李潔，鄭娟，周黎明*

(寧波市婦女兒童醫院，寧波315012)

隨著輔助生殖技術的發展，卵胞漿內單精子注射(ICSI)技術為眾多不孕不育夫婦帶來了生育可能。精子的質量對于胚胎的生長發育和ICSI的臨床結局有著至關重要的影響。先進的精子篩選技術可以提高具有高度DNA完整性的、結構完整的成熟精子用于受精的機會。本文簡要綜述了現有的ICSI精子優選技術及其對ICSI結局的影響，希望為ICSI技術的臨床應用與進一步的發展提供新的思路。

卵胞漿內單精子注射；精子篩選；輔助生殖技術

(JReprodMed2016，25(9)：856-860)

卵胞漿內單精子注射(ICSI)技術是一種利用顯微操作將單個精子注射到卵胞漿內，卵母細胞受精后，經體外培養形成早期胚胎，再選擇優質胚胎移植到母體子宮內著床發育的一種輔助生殖技術。ICSI技術的應用，大大降低了輔助生殖所需精子的濃度、活動力和形態學標準，為眾多不孕不育的夫婦帶來了生育可能。

正常生殖過程中，能與卵細胞進行受精的精子必須具有各種生理學功能并且通過重重障礙，例如穿過卵細胞透明帶，然而ICSI技術繞過了正常生殖的絕大部分步驟，人為選擇形態正常的精子注射進入了卵細胞[1]。因此，所選精子的質量對于ICSI結局有著尤為重要的影響。目前，精液樣本主要經過直接洗滌法、密度梯度離心法或上游法等處理[2]，然后將適量精子加入到聚乙烯吡咯烷酮溶液中，經顯微鏡下觀察，從中選擇形態正常(頭部呈卵圓形，長4.0～5.5 μm，寬1 μm；頂體占整個頭部的40%～70%；頸部、中段或尾部無異常)、活動力良好(前向運動)的精子注射到卵細胞胞漿中。然而，人為選擇的形態正常、活動力良好的精子，并不能確保其遺傳物質正常。有研究發現，具有明顯正常形態的精子也可能含有DNA碎片，而具有受損DNA的精子比例與ICSI所得胚胎的質量和妊娠結局呈負相關[3]。反之，用異常形態的精子，如圓頭精子和異常軸絲的精子進行ICSI，已有健康嬰兒出生[4-5]。因此，除了現有的常規的精子活動力和形態學檢查標準之外，發現新的優化的ICSI精子選擇技術，對于提高ICSI的成功率具有重要意義。本文簡要綜述了現有的ICSI精子優選技術及其對ICSI結局的影響，希望為ICSI技術的臨床應用與進一步的發展提供新的思路。

一、透明帶(ZP)結合實驗

人的卵細胞ZP能選擇性地結合具有正常染色質和正常功能的精子。ZP結合實驗即將人成熟卵細胞與精子置于同一微滴中，共培養一段時間，從而選出能與ZP結合的精子。Paes等[6]將每位患者的成熟卵細胞分為數量相等的兩組，一組進行ICSI，另一組進行ZP-ICSI(即將能與ZP結合的精子注射入卵胞漿)，比較分析后發現，雖然兩組間的受精率差異并不顯著，但ZP-ICSI組的高質量胚胎率和胚胎移植率均顯著高于常規ICSI組。Black等[7]也發現，相比常規ICSI，ZP-ICSI的移植率和臨床妊娠率有所增高。說明ZP結合實驗可能是一種有效的ICSI精子優選方法。金銳等[8]則將患者分為兩組，一組進行常規ICSI，一組進行ZP-ICSI，比較兩組患者的受精率和卵裂率均顯示無顯著差異，但ZP-ICSI組的優胚率、可利用胚胎率和臨床妊娠率均高于常規ICSI組。Casciani等[9]也將患者分為兩組，一組進行常規ICSI，一組進行ZP-ICSI，比較兩組間的受精率、妊娠率、移植率和活產率顯示均無顯著差異，但對ZP-ICSI組的患者進行分析發現，精子與ZP的結合率與精子濃度及正常形態率正相關，并且，具有高ZP結合率精子的患者ICSI后妊娠率與活產率更高，說明ZP結合能力受損的精子并不適用于ICSI技術。

綜上所述，ZP結合實驗雖然能選出質量更佳的精子，但對于ICSI結局的改善仍存在爭議，可能并不適用于所有不孕不育患者。并且，可用于結合實驗的卵細胞數量十分有限，難以大規模地應用于臨床。

二、透明質酸(HA)結合實驗

精子形成時，在精子細胞膜重塑過程中，ZP受體形成，HA受體也隨之形成。因此，能與HA結合的精子也可以與ZP結合，并且HA可大量體外合成，比ZP更易獲得。HA結合實驗即將HA微粒與精子置于同一微滴中，共培養一段時間，從而篩選出能與HA牢固結合的精子。

已有大量研究發現，能與HA結合的精子的非整倍體率更低[10]；具有DNA碎片、精蛋白缺陷的風險更小，用于ICSI時受精率、妊娠率和移植率均顯著提高[11]；含有正常形態細胞核的比率更高，發育形成的胚胎質量更好[12]。也有研究報導，HA-ICSI(即將能與HA結合的精子注射入卵胞漿)可增加活產率，降低流產率和遺傳并發癥[13]。Parmegiani等[14]對86例進行常規ICSI的患者與293例進行HA-ICSI的患者的受精率、胚胎質量、移植率和妊娠率進行了比較分析，發現相比常規ICSI組，HA-ICSI組患者的胚胎質量和移植率顯著增高，說明ICSI前進行HA結合實驗有助于選出高質量的精子，改善輔助生殖技術的結局。

反之，也有研究發現，HA結合實驗選出的精子與訓練有素的胚胎學家根據傳統形態學標準在顯微鏡下挑選出的精子無顯著的DNA完整性的差異[15]。而且，僅在嚴重畸形或者HA結合能力差的精液樣本中，HA-ICSI才有助于受精率和妊娠率的提高[16]。這提示我們，HA結合實驗可能僅對于嚴重男性因素不育的患者具有重要價值。Majumdar等[17]對精液參數正常、不明原因不孕的156位患者進行研究，發現相比常規ICSI，HA-ICSI并不能提高受精率、優質胚胎數量、臨床妊娠率和移植率，但能降低流產率，這可能是由于精子基因組對胚胎形成的影響主要發生在晚期(從8細胞期到分娩)，因此，精子的DNA碎片率更可能影響流產率，而不太可能影響受精率、卵裂速度和受精后2～3 d的胚胎質量。

綜上所述，HA結合實驗對ICSI精子的優選具有重要意義。雖然對于HA結合精子的DNA碎片率和其對ICSI臨床結局的影響等仍存在爭議，這可能是由于HA結合實驗僅對部分不孕不育患者有益，如精子與HA結合率低的患者。要想更確切地了解HA結合實驗對ICSI結局的影響，還有待進一步地研究。

三、Zeta電位篩選

成熟精子的細胞膜表面電位約為-16～-20毫伏，稱為Zeta電位，在精子獲能之后，Zeta電位下降。利用精子的這個特點，Kheirollahi-kouhestani等[18]將離心管放入乳膠手套中，上下顛倒2～3次，使離心管管壁帶正電荷，用于黏附帶負電荷的精子，離心去除不能與管壁黏附的精子，然后加入含10%白蛋白的F10培養液中和電荷，洗脫并獲得了黏附于管壁的精子；并且發現，利用Zeta電位篩選出的精子具有較低的DNA碎片率，可提高ICSI的受精率和妊娠率。Ainsworth等[19]用微流體靜電技術，電泳分離出了具有正常Zeta電位的精子，也證實了上述結論。Razavi等[20]對Zeta電位篩選出的精子、HA結合實驗篩選出的精子和未經篩選的精子進行比較分析，發現兩種篩選方法均可提高精子的正常形態率和正常頂體率，并且Zeta電位篩選出的精子的DNA完整性顯著高于HA結合實驗篩選出的精子和未經篩選的精子。目前，有關利用Zeta電位篩選精子的報導數量還十分有限，該技術的安全性、適用性和有效性還有待進一步的研究。

四、細胞凋亡標志物篩選

在體細胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)外部化，即從細胞膜內層轉移到外層，是細胞凋亡的早期標志之一。然而，此過程也是正常精子獲能過程中的一個步驟。因此，在精子獲能之前檢測到的外部化的PS是精子早期凋亡的標志[21]。外部化的PS可與膜聯蛋白V特異性的結合，利用磁激活細胞分離(MACS)的方法，可將膜聯蛋白陰性的精子即未發生早期凋亡的精子篩選出來。Dirican等[22]發現，用MACS篩選出的未凋亡精子進行ICSI，卵裂率、移植率和妊娠率均有所提高。并且，在對精子進行密度梯度離心之前進行MACS篩選比在離心后進行MACS篩選更有益于分離出高質量的精子[23]。

Zahedi等[24]對Zeta電位篩選出的精子、細胞凋亡標志物篩選出的精子和未經篩選的精子進行了質量評估，發現相比未經篩選的精子，兩種方法篩選出的精子均具有更高的正常形態率，更低的DNA碎片率和精蛋白缺陷率，這說明用Zeta電位和細胞凋亡標志物進行篩選均可提高ICSI精子的質量；并且，對于嚴重男性因素不育的患者，用細胞凋亡標志物能更有效地選出具有正常頂體和精蛋白的精子。

綜上所述，根據細胞凋亡標志物對ICSI精子進行篩選，可有效提高精子質量，有益于提高ICSI結局，有望成為新的精子篩選指標。

五、精子雙折射檢測

雙折射效應是光線射入非均質物質后，由于速度不同而折射出的兩道不同偏振光線間存在相位延遲而產生。具有正常細胞核、頂體和能動的尾部的精子質地致密，細胞質非均質，在透射電子顯微鏡下會出現雙折射的現象[25]。

Gianaroli等[26]用偏振光顯微鏡檢測精子的雙折射，可獲得與透射電子顯微鏡相似的精子內部細胞質結構信息，而不影響精子的生命力和活動力，且發現正常精液樣本中的雙折射精子比例顯著高于寡畸精子癥或睪丸取精獲得的精液樣本；并且，對于嚴重男性因素不育的患者，卵胞漿內注射具有雙折射現象的精子比行常規ICSI術具有更高的臨床妊娠率、繼續妊娠率和移植率。

雙折射現象還可以區分精子是否已發生頂體反應，若雙折射現象出現在頂體后部，則精子已發生了頂體反應；若雙折射現象在頭部、頂體和細胞核均有出現，則表明精子具有完整的頂體，還未發生頂體反應。在ICSI中，注射已發生頂體反應的精子有助于誘導卵細胞激活和進一步的生長發育[27-28]，增加受精率和卵裂率[29]。Gianaroli等[30]根據精子的雙折射特點，將71對嚴重男性因素不育的夫婦分成3組，分別卵胞漿內注射已發生頂體反應的精子(已反應組)、未發生頂體反應的精子(未反應組)、和既有已發生頂體反應的也有未發生頂體反應的混合精子(混合組)，比較3組間的ICSI結局，發現受精率和胚胎發育能力在3組間沒有顯著差異，而移植率和分娩率均為已反應組>混合組>未反應組，且已反應組和未反應組間差異顯著。從生理角度解釋，卵胞漿內注射已發生頂體反應的精子更接近自然地受精過程，因此有助于所獲胚胎的生長發育。

綜上所述，精子雙折射的檢測作為一種無創的技術手段，有助于改善嚴重男性因素不育患者的ICSI結局，有望成為一種新型的精子篩選方法和診斷工具。

六、能動精子細胞器的形態學檢查

能動精子細胞器形態學檢查是在超高放大倍數(≥6 000倍)顯微鏡下觀察分析精子的亞細胞結構：頂體、頂體后板、頸部、尾部和細胞核。用經細胞器形態學檢查的精子進行ICSI的技術被稱為胞漿內形態學選擇精子注射(IMSI)技術[31]。

有研究發現，對常規ICSI反復失敗的患者進行IMSI，可提高所獲得的胚胎質量，顯著提高移植率、臨床妊娠率和活產率，顯著降低流產率[32-33]。Balaban等[34]研究發現，在未經選擇的不育患者中，IMSI并不能改善臨床結局，而在嚴重男性因素不育的患者中，相比ICSI，IMSI的移植率有顯著提高。Setti等[35]研究發現，對卵巢刺激正常應答的患者，IMSI和ICSI的結局無明顯差異；而對卵巢刺激應答不良的患者，相比ICSI，IMSI的受精率和移植胚胎的數量有所下降，說明IMSI不利于對卵巢刺激應答不良的患者。La Sala等[36]對48位采取IMSI的患者和73位采取ICSI的患者進行了隨機對照試驗，發現兩組患者的臨床妊娠率和活產率均無顯著差異。綜上所述，在不同的患者亞群中，能動精子細胞器的形態學檢查對于輔助生殖技術的結局有著截然不同的影響，目前還不適合在未經選擇的不育患者中進行大規模的臨床推廣。

有限的卵細胞數量和不理想的精子質量是ICSI技術的成功率不盡人意的兩個瓶頸。卵細胞的數量受到生理條件限制難以大幅度提升，因此，從精液樣本中挑選出高質量的精子進行ICSI顯得尤為重要。目前已有的ICSI精子優選技術都能一定程度上提高所選精子的質量，但對不同患者的適用性不同，可能僅能提高部分患者的ICSI結局。因此，將不孕不育患者分成不同的亞群，分別運用不同的精子優選方法，進行個體化治療，可能是未來精子優選技術和輔助生殖技術的發展趨勢。此外，這些精子優選技術要想進行大規模的臨床應用，還需要進行嚴格地安全性評估。

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[編輯：郭永]

Research progress on advanced sperm selection techniques for intracytoplasmic sperm injection

LI Jie，ZHENG Juan，ZHOU Li-ming*

NingboWomen&Children’sHospital，Ningbo315012

With the development of assisted reproductive technology，intracytoplasmic sperm injection (ICSI) brings childbearing potential to many infertile couples. Sperm quality plays an important role in embryo development and ICSI outcome. Advanced sperm selection techniques can improve the selection of sperms which possess structural intact and high DNA integrity for fertilization. This review summarizes the influence of current sperm selection techniques to the outcome of ICSI，and provides some new ideas for the clinical application and further development of ICSI.

Intracytoplasmic sperm injection；Sperm selection；Assisted reproductive technologies

10.3969/j.issn.1004-3845.2016.09.019

2015-11-21；

2016-01-11

寧波市自然科學基金(2011A610035)

李潔，女，寧波人，碩士，基礎醫學專業.(*

，Email：zhou.li.ming@163.com)