HbA1c水平對2型糖尿病患者紅細胞及胞內血紅蛋白的影響*

葉少英，　阮　萍，　雍軍光，　沈洪濤，　廖志紅，　董曉蕾

(1廣東藥學院勞動衛生與環境衛生學系，廣東 廣州 510315； 2廣東藥學院生物醫學工程系，廣東 廣州 510310； 3廣東藥學院附屬門診部內分泌科，廣東 廣州 510235； 4廣西師范大學物理科學與技術學院，廣西 桂林 541001； 5中山大學附屬第一醫院內分泌科，廣東 廣州 510080)

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HbA1c水平對2型糖尿病患者紅細胞及胞內血紅蛋白的影響*

葉少英1，阮萍2△，雍軍光3，沈洪濤4，廖志紅5，董曉蕾1

(1廣東藥學院勞動衛生與環境衛生學系，廣東 廣州 510315；2廣東藥學院生物醫學工程系，廣東 廣州 510310；3廣東藥學院附屬門診部內分泌科，廣東 廣州 510235；4廣西師范大學物理科學與技術學院，廣西 桂林 541001；5中山大學附屬第一醫院內分泌科，廣東 廣州 510080)

[摘要]目的： 探討不同糖化血紅蛋白(HbA1c)水平對2型糖尿病(T2DM)患者紅細胞及胞內血紅蛋白(Hb)的影響。方法：選取健康人30名為對照組(H組)，T2DM患者102例，按HbA1c水平分為3組：血糖控制良好組(A組)30例(HbA1c <7.0%)；血糖控制較差組(B組)36例(7.0%≤HbA1c<9.0%)；持續高血糖組(C組)36例(HbA1c≥9.0%)。利用新型靜態顯微圖像分析技術和紫外-可見光譜技術，對各組紅細胞及胞內Hb進行檢測。結果：與H組比較，A、B、C組紅細胞的圓度因子明顯增大(P<0.05)且與HbA1c水平呈正相關；B組紅細胞的截面積和C組紅細胞的全部形態參數均較H組明顯增大(P<0.05)；A、B、C組，除A、B組間紅細胞長短軸參數無顯著差異，其它組間參數比較差異有統計學顯著性。與H組比較，A、B、C組Hb的紫外-可見光譜的譜型和譜峰未出現明顯差異，但B、C組Hb的吸光度較H組明顯下降(P<0.01)，且C組Hb的吸光度也明顯低于A組(P<0.05)，隨HbA1c水平的升高呈逐漸下降趨勢。結論：隨HbA1c水平的升高，T2DM患者紅細胞的形態發生改變，變形功能逐漸減弱，胞內Hb的結構可能發生改變。

[關鍵詞]HbA1c； 紅細胞； 血紅蛋白； 2型糖尿病

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一類病因尚未明確的非胰島素依賴型的終身性疾病，可引發嚴重并發癥，已成為繼癌癥和冠心病之后的又一嚴重威脅人類健康的全球性疾病[1]。糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin type A1c，HbA1c)是評價患者血糖控制情況、療效判定和預測并發癥的重要指標。已有研究表明，HbA1c水平升高加重了糖尿病患者體內的氧化應激[2]，增加了全血黏度和血小板的聚集[3]，與糖尿病多種并發癥的發生發展密切相關，是糖尿病發病機制的重要影響因素。

T2DM是多病因所致的內分泌疾病，從血液循環系統入手研究其發病機制具有重要意義。紅細胞是人體重要的循環細胞，主要承擔人體內O2和CO2的運輸，這一功能的正常發揮取決于紅細胞的形態以及胞內血紅蛋白(hemoglobin，Hb)的結構和功能。已有研究報道，溫度、pH值、滲透壓等生存環境的改變可引起紅細胞形態、變形性以及Hb結構改變，導致紅細胞和Hb的功能受損，生理活性降低[4-6]。這些改變都會引起微血管的血液流變學改變，引發微循環障礙。T2DM患者的高血糖改變了正常的血液環境，可能影響紅細胞和Hb的結構及功能，但當前仍缺少HbA1c水平對單個紅細胞的具體形態、變形性以及胞內Hb影響的分析。

本研究利用新型顯微靜態圖像分析技術對健康人和不同HbA1c水平的T2DM患者的單個活態紅細胞的形態進行觀察和測量，同時結合紫外-可見光譜技術對紅細胞內的Hb進行檢測分析，探討HbA1c水平對T2DM患者紅細胞及胞內Hb的影響。

材料和方法

1研究對象

選取2015年1～7月期間于中山大學附屬第一醫院體檢的健康人為對照組，內分泌科住院的T2DM患者為病例組。其中，健康人30名(H組；男15例，女15例)，確診T2DM患者102例，均以黃脲類聯合雙胍類治療，如血糖控制不佳者改為胰島素強化治療，按其HbA1c水平分為3組：血糖控制良好組(A組)30例(HbA1c<7.0%；男15例，女15例)；血糖控制較差組(B組)36例(7.0%≤HbA1c<9.0%；男18例，女18例)；持續高血糖組(C組)36例(HbA1c≥9.0%；男20例，女16例)。上述研究對象的性別、年齡無顯著差異。入選標準：(1)符合1999年WHO糖尿病診斷標準；(2)無急慢性糖尿病并發癥；(3)無惡性腫瘤、嚴重感染等疾病，無心、腦、腎等重要器官并發癥及消化系統疾病；(4)無貧血等血液系統疾病，近1個月內未使用抗生素免疫抑制劑、抗血小板凝集類藥物。

2方法

2.1樣本采集與臨床指標測定所有研究對象均禁食8 h，次晨空腹抽取靜脈血3 mL,EDTA-K2抗凝，測定空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)和HbA1c。FPG采用葡萄糖氧化酶法，HbA1c采用高效液相法。記錄研究對象的性別、年齡，測量其身高、體重，計算體重指數(body mass index，BMI)。

2.2紅細胞形態測定1 mL全血2 000 r/min離心5 min，除上層血漿，血小板及白細胞，余壓積紅細胞。以等滲PBS[6]混勻紅細胞，2 000 r/min離心5 min，重復洗滌3次，至上清液澄清透明。以1∶1 000抽取洗滌后壓積紅細胞與含5%小牛血清白蛋白的PBS (pH 7.4)配制紅細胞懸液，用于檢測紅細胞靜態形態。將制好的紅細胞懸液置于Nikon TS100-F倒置顯微鏡下，利用自主研發的新型顯微成像系統[7]觀察和拍攝紅細胞的靜態圖像，結合顯微圖像分析技術和Image-Pro Plus 6.0專業分析軟件對每個紅細胞的接觸面積、長短軸以及圓度因子(roundness effect factor，REF)等幾何參數進行測量分析。每個樣本測量50～80個細胞。

2.3胞內Hb光譜測定取1.5 mL抗凝全血，2 000 r/min離心10 min，除上層血漿、血小板及白細胞。壓積紅細胞以10倍體積預冷的0.9% NaCl溶液混勻，3 500 r/min離心5 min，除上清，重復洗滌3次。以10倍體積預冷蒸餾水振動裂解紅細胞，置4 ℃冰箱過夜，充分釋放胞內Hb。次日4 ℃、12 000 r/min離心45 min，抽取上層Hb粗提液，0.22 μm一次性濾膜過濾后以葡聚糖G-75凝膠柱純化，收集洗脫液，并以SDS-PAGE進行Hb純度鑒定，純度達到95%以上，Hb透析除鹽濃縮后置于4 ℃保存。

取100 μL純化Hb溶液，以2 mL去離子水稀釋，待測。采用島津UV-3010型紫外-可見光譜儀，掃描范圍190～800 nm，波長精度±0.1 nm，測定各樣本的紫外-可見吸收光譜，每個樣本重復測定3次，取其均值圖譜分析。

3統計學處理

數據采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，所有數據均進行正態性檢驗，不符合正態分布的參數進行秩和檢驗，符合正態分布的參數統一以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1各組臨床資料比較

健康對照組H與病例組A、B、C的年齡、性別差異無統計學顯著性，與H組相比，B、C組的BMI明顯升高，差異有統計學顯著性(P<0.05)。與H組相比，A、B、C組的FPG以及HbA1c水平明顯增高(P<0.05)；與A組相比，B、C組的FPG以及HbA1c水平明顯升高(P<0.05)；C組FPG以及HbA1c水平均較A、B組明顯升高(P<0.05),見表1。

表1　4組病人的一般臨床資料比較

*P<0.05vsgroup H;#P<0.05vsgroup A;△P<0.05vsgroup B.

2各組紅細胞形態參數比較

紅細胞的接觸面積、長軸、短軸和REF是描述紅細胞形態的指標，表2為H組與A、B、C組的紅細胞形態參數分析結果。由表1可知，T2DM患者的紅細胞形態參數均隨HbA1c水平升高逐漸增大。A組紅細胞的接觸面積、長軸和短軸與H組比較差異無統計學顯著性；B組紅細胞除接觸面積明顯大于H組外，其長短軸參數與H組比較差異無統計學顯著性；C組紅細胞的全部形態參數均明顯大于H組(P<0.05)。A、B、C組，除A、B組間紅細胞長短軸參數的差異無統計學顯著性外，其它參數的組間比較差異有統計學顯著性(P<0.05)。與H組相比，A、B、C組的REF均明顯增大(P<0.05)，且A、B、C組間差異有統計學顯著性(P<0.05)，隨HbA1c水平的升高逐漸增大。

3T2DM患者HbA1c水平與紅細胞REF相關性分析

REF是衡量紅細胞變形性的重要參數，其值在0～1之間，與紅細胞的變形能力呈負相關，REF越小表明紅細胞的變形能力越好，若REF趨近于1，表明紅細胞趨近于圓球形，剛性越大。為進一步分析HbA1c水平對T2DM患者紅細胞變形能力的影響，對患者的HbA1c水平與紅細胞REF描繪散點圖并進行直線相關分析,結果表明患者的REF與HbA1c水平呈正相關(r2=0.657，P<0.01),見圖1。

4各組Hb紫外-可見光譜比較

以H組Hb的平均紫外-可見光譜為對照，與A、B、C組Hb的平均光譜進行對比分析。Hb的紫外-可見吸收光譜主要有5個吸收峰，其中414 nm歸屬于血紅素的特征吸收峰，540 nm和576 nm分別為氧合血紅蛋白(HbO2)的α和β吸收峰，可反映Hb的攜氧能力，因此本文主要針對這3個吸收峰進行分析。4組Hb吸收光譜的譜型、譜峰相似，無顯著差異，但各組Hb的吸光度差異顯著。因此，對4組Hb的414 nm、540 nm以及576 nm的吸光度值進行比較顯示，A組與H組Hb的吸光度差異無統計學顯著性，但B、C組Hb的吸光度均較H組明顯下降(P<0.01)；與A組相比，B組Hb的吸光度降低，但差異無統計學顯著性，C組Hb的吸光度較A組明顯降低(P<0.05)，A、B、C組Hb的吸光度呈現隨HbA1c水平的升高而逐漸下降的趨勢，見圖2。

表2　4組紅細胞的形態參數比較

REF: roundness effect factor.*P<0.05vsgroup H;#P<0.05vsgroup A;△P<0.05vsgroup B.

Figure 1.The scatter plot of HbA1c level and the roundness effect factor (REF) of the erythrocytes.

圖1HbA1c水平與紅細胞圓度因子的散點圖

討論

T2DM是以慢性高血糖為主要特征，伴有糖、脂肪、蛋白質等代謝紊亂的內分泌疾病。隨病程的發展，患者的毛細血管基底膜增厚，微血管管腔狹窄導致微循環障礙，引發微血管病變等慢性并發癥[8]。HbA1c與患者血糖水平呈正相關，可良好地反映患者近8～12周的平均血糖水平，是糖尿病長期控制情況的指標之一。紅細胞變形能力和生理功能的正常發揮是保證微循環有效灌注的重要條件，也是從血液流變學角度探討T2DM及其并發癥發生發展機理和預防的重要手段和客觀指標，其中紅細胞的形態和胞內Hb結構是影響紅細胞變形能力和功能的重要因素[9]。紅細胞的形態、大小對其變形能力有反作用，紅細胞的直徑和表面積越大，紅細胞的變形能力越低。實驗結果表明，A、B、C病例組紅細胞的截面積和長短軸均大于對照組H，提示T2DM患者紅細胞的形態和變形能力可能已受損。A、B、C組紅細胞的截面積、長短軸逐漸增大且組間差異顯著，表明HbA1c水平的升高，可能影響紅細胞的形態變化。由于T2DM患者長期血糖控制不良易導致HbA1c水平升高，高血糖環境的作用可能使紅細胞的截面積和直徑均增大，形態大小改變，從而降低紅細胞的變形性。REF為紅細胞的長短軸之比，REF高表示紅細胞變形能力下降，A、B、C組紅細胞的REF均顯著大于H組，提示T2DM患者的紅細胞已從雙凹形結構逐漸轉化為近球型[9]，紅細胞變形能力降低。進一步分析T2DM患者HbA1c水平與REF的關系，結果表明兩者呈正相關，提示HbA1c水平的升高，高血糖可能與紅細胞膜蛋白產生糖基化作用[10]，使紅細胞膜的成分和結構改變，導致紅細胞膜流動性減弱、剛性增大，促使紅細胞趨近圓球型結構，從而降低紅細胞的變形能力，與相關研究結論相符[11]。

Figure 2.The average ultraviolet-visible spectra of the normal Hb (H) and the Hb of the T2DM patients (A, B and C), and the absorbance change at 414 nm, 540 nm and 576 nm in different groups.**P<0.01vsgroup H;#P<0.05vsgroup A.

圖2各組Hb的紫外-可見吸收光譜以及在414 nm、540 nm和576 nm處吸光度值

Hb吸收峰的高度不僅與紅細胞內Hb溶液濃度的高低有關,而且還與Hb的理化性質(如溶解性、穩定性和氧化狀態等)有關[6]。結果表明，A組Hb的紫外-可見吸收光譜與H組相似，未出現顯著差異，但B、C組Hb的吸光度均顯著低于H組，提示T2DM患者的Hb可能發生改變。A、B、C組Hb的血紅素和HbO2的吸光度隨HbA1c水平升高逐漸降低，且A、C組間差異顯著。Hb是紅細胞的重要內容物，紅細胞的內黏度對紅細胞的變形能力有反作用。實驗結果提示，HbA1c水平的升高，T2DM患者的高血糖狀態可使葡萄糖滲入到紅細胞內部，使紅細胞內的Hb發生非酶糖化，Hb發生聚集，可溶性降低，致使紅細胞的內黏度增大，紅細胞變形能力下降。高血糖可能也加速了患者體內的糖基化反應，Kristinsson等[12]研究表明蛋白糖基化反應可降低血液環境的pH，引起Hb結構穩定性下降，Hb的血紅素環發生位移或降解[13]，影響Hb的結構，降低Hb與氧的親和力，減弱Hb攜氧運氧的功能，使周圍組織供氧不足，這可能是造成糖尿病慢性并發癥的重要原因之一[14]。此外，持續高血糖也可能加劇患者體內的氧化應激，導致自由基等氧化應激產物增加，可能引起Hb結構改變，影響Hb的生理功能[15]，致使HbO2含量減少，加速糖尿病并發癥的發生發展。

實驗結果表明，T2DM患者紅細胞的變形能力隨HbA1c水平的升高逐漸降低，Hb的結構也可能改變，提示HbA1c水平可能是造成T2DM患者紅細胞變形能力降低的重要因素，患者的血脂異常等其它因素也可能起協同作用使紅細胞變形能力進一步降低。紅細胞變形能力降低和胞內Hb結構改變，可使紅細胞僵硬難以通過微血管，引起微循環障礙，使周圍血管的血流量減少，紅細胞攜氧釋氧的能力降低，加重周圍組織缺血缺氧，促進糖尿病高黏血癥、糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變等并發癥的發生發展。嚴格控制患者的HbA1c水平，早期注重改善患者紅細胞的變形能力及預防胞內Hb結構和功能的改變，將有助于提高2型糖尿病的療效，預防糖尿病并發癥的發生發展。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effect of HbA1c level on erythrocytes and hemoglobin in type 2 diabetics

YE Shao-ying1, RUAN Ping2, YONG Jun-guang3, SHEN Hong-tao4, LIAO Zhi-hong5, DONG Xiao-lei1

(1DepartmentofOccupationalandEnvironmentalHealth,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510315,China;2DepartmentofBiomedicalEngineering,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510310,China;3DepartmentofEndocrinology,TheAffiliatedOutpatientDepartmentofGuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510235,China;4CollegeofPhysicsandTechnology,GuangxiNormalUniversity,Guilin541001,China;5DepartmentofEndocrinologyofTheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail: 326737727@qq.com)

[ABSTRACT]AIM: To explore the effect of HbA1c level in the patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM) on the rheological properties of erythrocytes and the structure of hemoglobin (Hb). METHODS: The patients with T2DM were classified into 3 groups: the patients with good glycaemic control (group A, HbA1c<7.0%), the patients with poor glycaemic control (group B, 7.0%≤HbA1c<9.0%) and the patients with persistent hyperglycemia (group C, HbA1c≥9.0%). The rheological properties of a single living erythrocyte were analyzed by the techniques of static imaging and analysis. Ultraviolet-visible spectroscopy was used to study the structure of Hb. RESULTS: Compared with group H, the roundness effect factor (REF) of erythrocytes, which was positively related with HbA1c level, was significantly increased in groups A, B and C (P<0.05). The contact area of erythrocytes in group B and all the morphological parameters of erythrocytes in group C were significantly higher than those in group H (P<0.05). There were significant differences among groups A, B and C in deformation capacity and elastic parameters of the cell membrane (P<0.05), but with no difference in the long axis and short axis between group A and group B. Compared with group H, no obvious change in the spectral pattern and spectrum peak of Hb in groups A, B and C was observed. However, the absorbance of Hb, which showed a trend of gradual decline with the increase in HbA1c level, in group B and group C was significantly decreased as compared with group H (P<0.01), and the Hb absorbance in group C were also lower than that in group A (P<0.05). CONCLUSION: With the increase in HbA1c level, the morphology along with the deformation function of erythrocytes in T2DM changes and declines gradually, and the structure of Hb may also change.

[KEY WORDS]HbA1c; Erythrocytes; Hemoglobin; Type 2 diabetes mellitus

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.027

[中圖分類號]R589.1; R363

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 020-39352207； E-mail: 326737727@qq.com

*[基金項目]廣東省科技計劃(No.2012B031800429; No.2014807)；國家自然科學基金資助項目(No.11265005)

[收稿日期]2015- 11- 02[修回日期] 2015- 12- 29

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0549- 05

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