周期性牽拉與TNF-α對角膜成纖維細胞增殖的影響

姚　艷,馮鵬飛,李曉娜,賀　瑞,陳維毅,王曉君

(1.太原理工大學 a.力學學院,b.應用力學與生物醫學工程研究所,太原030024;

2.山西省眼科醫院 準分子激光室,太原 030002)

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周期性牽拉與TNF-α對角膜成纖維細胞增殖的影響

姚艷1a,馮鵬飛1b,李曉娜1b,賀瑞2,陳維毅1b,王曉君1a

(1.太原理工大學 a.力學學院,b.應用力學與生物醫學工程研究所,太原030024;

2.山西省眼科醫院 準分子激光室,太原 030002)

摘要:利用Flexcell4000柔性基底拉伸系統對角膜成纖維細胞實施應變為5%或15%、頻率為0.1 Hz的周期性牽拉載荷,用質量濃度為1 ng/mL或10 ng/mL的腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)處理,并采用流式細胞儀檢測細胞周期,研究周期性牽拉與TNF-α對角膜成纖維細胞增殖的影響。結果表明:5%周期性牽拉或TNF-α單獨作用對正常及圓錐角膜成纖維細胞S期細胞比例均無顯著性影響;15%牽拉使正常及圓錐角膜成纖維細胞S期細胞比例均顯著下降;與正常角膜相比,15%牽拉和TNF-α共同作用使圓錐角膜S期細胞比例下降更顯著。周期性牽拉及TNF-α可能通過抑制圓錐角膜基質細胞增殖參與圓錐角膜的發生和發展。

關鍵詞:周期性牽拉;腫瘤壞死因子;圓錐角膜;成纖維細胞;細胞增殖

圓錐角膜是一種原發性角膜退變性疾病。通常發生于青春期前后,常表現為雙眼先后進行性發病,發病率介于0.05%～0.23%之間,與性別種族無關[1]。目前病因尚不清楚,可能與眼角膜損傷有關[2]。角膜基質細胞是正常角膜基質中的主要細胞成分,在眼角膜未受損傷的情況下,角膜基質細胞處于相對靜止狀態,細胞呈扁平多突起狀,通過細胞突起頂部的縫隙連接與相鄰細胞發生聯系。在眼角膜受到損傷時,原本處于靜止狀態的角膜基質細胞被激活,轉變為修復表型,被稱作角膜成纖維細胞。激活后的角膜成纖維細胞遷移到受損傷的角膜基質附近,參與組織修復過程。與角膜基質細胞相比,成纖維細胞的細胞形態發生明顯改變,由原來的扁平多突起狀態轉變成長梭形,細胞功能也發生顯著變化,細胞合成和分泌細胞外基質的水平大大提高。此時,它的增殖平衡對于角膜的透光性、屈光性及保護、防御功能的發揮至關重要[3]。

在圓錐角膜疾病發展過程中,角膜會受到不同程度力的刺激,但角膜成纖維細胞的增殖在力學刺激下是如何響應的,目前尚不清楚。有文獻報道，炎性因子TNF-α在圓錐角膜中的表達明顯增高,它在調節炎癥反應和調節細胞生存或死亡方面起著重要作用[4],可能參與了圓錐角膜的發生和發展[5-6]。而TNF-α對角膜成纖維細胞增殖的影響仍不清楚。在生理環境中,細胞的增殖會受到多種因素的共同作用。因此,研究周期性牽拉和炎性因子TNF-α單獨或聯合作用對角膜成纖維細胞增殖的影響十分重要。

本文通過對體外培養的正常人和圓錐角膜患者的角膜成纖維細胞給予周期性機械牽拉和TNF-α處理,研究周期性牽拉和TNF-α對角膜成纖維細胞增殖的影響,進而探究圓錐角膜的發病原因和發展機制,為手術治療、術后恢復提供參考和理論依據。

1材料與方法

1.1細胞提取與培養

圓錐角膜和正常角膜均取自于山西省眼科醫院。圓錐角膜患者1:男,1985年生,2003年被診斷為圓錐角膜,2013年底施左眼角膜移植術。圓錐角膜患者2:男,1997年生,2005年視力開始下降,2012年初被診斷為圓錐角膜,2012年底施左眼角膜移植術,2013年底施右眼角膜移植術。首先機械剝離上皮層和內皮層,然后用2 mg/mL的Ⅱ型膠原酶消化組織塊,直至培養液完全清亮。離心后獲得角膜成纖維細胞,加入胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)體積分數為10%的F12全血清培養基,置于37 ℃、二氧化碳體積分數為5%的孵箱內培養,細胞覆蓋培養皿90%左右時進行傳代。本文研究采用第五代角膜成纖維細胞。文中NC(Normal cornea)代表正常角膜,KC(Keratoconus)代表圓錐角膜。KC1和KC2分別代表患者1、患者2的圓錐角膜。

1.2細胞周期性牽拉及TNF-α處理

采用Flexcell4000柔性基底拉伸系統(美國Flexcell)對角膜成纖維細胞實施周期性機械牽拉。該系統通過真空泵產生的負壓抽吸特制的柔性培養膜,使黏附生長在培養膜上的細胞受到周期性牽拉作用。整個加載裝置放置于培養箱內,加載程序由Flexcell4000計算機軟件自動控制。本文采用應變為5%和15%，頻率為0.1 Hz的正弦波周期性力學加載來模擬角膜受力。

角膜成纖維細胞用質量分數為0.25%的胰蛋白酶消化,以3×105mL-1的細胞密度接種于裱襯有I型膠原蛋白的BioFlex彈性膜六孔培養板(美國Flexcell)上,置于孵箱內培養。待細胞80%融合時,換成不含FBS的DMEM/F12(Dulbecco′s Modified Eagle Media:Nutrient Mixture F-12)培養基進行饑餓處理。12 h后添加含TNF-α(質量濃度分別為0，1，10 ng/mL)的全血清培養基,同時進行周期性力學加載,以靜態培養組(未施加載荷)作為對照,每組重復3次實驗。12 h后收集細胞,采用流式細胞儀檢測細胞周期，觀察細胞增殖情況。本研究中TNF-α質量濃度的選擇參考了以前文獻中所采用的TNF-α質量濃度[7-9]。

1.3細胞周期檢測

用PBS清洗細胞,然后用質量分數0.25%的胰蛋白酶消化，再加入FBS體積分數為10%的F12培養基終止消化,并吹打成單細胞懸浮。1 000 r/min離心5 min,棄上清,加入預冷的70%乙醇,采用流式細胞儀進行細胞周期檢測。本文以S期細胞百分比變化情況考察細胞增殖情況。

1.4統計學分析

2結果

NC:Normal cornea; KC:Keratoconus圖1　單獨周期性牽拉對人角膜成纖維細胞增殖的影響Fig.1　The effects of cyclic stretch on human corneal fibroblasts

流式細胞儀檢測圖中，橫坐標為熒光信號強度(用道數表示),與DNA含量成正比;縱坐標表示相對細胞數；第一峰為G1期細胞,第二峰為S期細胞(圖1)。由圖1可知,靜態培養條件下,NC，KC1，KC2組角膜成纖維細胞處于S期細胞的比例無顯著性差異。單獨周期性牽拉12 h后,與靜態組相比,5%周期性牽拉對NC，KC1，KC2組處于S期的細胞比例無顯著性影響；15%周期性牽拉時NC，KC1，KC2組處于S期的細胞比例顯著下降(P<0.05),這說明高應變條件下角膜成纖維細胞增殖受到抑制。

靜態培養下,加入1 ng/mL或10 ng/mL TNF-α時,NC，KC1，KC2的S期細胞數比例有所下降,但無顯著性差異(P>0.05)(圖2)。這說明TNF-α單獨作用對正常及圓錐角膜成纖維細胞增殖均無顯著性影響。

圖2　TNF-α對人角膜成纖維細胞增殖的影響Fig.2　The effects of TNF-α on the proliferationof human corneal fibroblasts

5%周期性牽拉和TNF-α聯合作用12 h后,NC，KC1組處于S期的細胞比例與靜態對照組比較無顯著性差異(P>0.05);與靜態對照組比較,KC2組S期的細胞比例顯著下降(P<0.05),且各組之間無顯著性差異(P>0.05)(圖3)。

當牽拉應變為15%時,添加1 ng/mL或10 ng/mL TNF-α后,NC，KC1，KC2組處于S期的細胞比例下降,且與NC組比較,KC組S期細胞比例下降更顯著(P<0.05),KC組之間無統計學差異(P>0.05)(圖3、表1)。這表明,15%周期性牽拉與TNF-α聯合作用對角膜成纖維細胞增殖無協同效應,高應變和TNF-α共同作用時抑制角膜成纖維細胞增殖,且對圓錐角膜成纖維細胞增殖抑制更顯著。

表1　15%牽拉下KC組與NC組細胞增殖顯著性差異分析

3討論

圓錐角膜屬于角膜病的一種,對視力有嚴重的影響,可導致失明。但其發生發展的機理尚不明確。

研究發現，該疾病可能與隱形眼鏡磨損和揉眼等機械性創傷有關[10]。而機械性創傷在導致人角膜力學微環境改變[11]的同時還使角膜中TNF-α因子表達增加[12]。但關于力學因素和TNF-α對人角膜成纖維細胞增殖的影響尚未見相關報道。

本文對正常角膜成纖維細胞和圓錐角膜成纖維細胞施加頻率為0.1 Hz、應變為5%或15%的周期性牽拉,并添加不同質量濃度的TNF-α處理,12 h后采用流式細胞技術檢測細胞周期。結果表明,高應變抑制角膜成纖維細胞增殖,且對圓錐角膜成纖維細胞增殖抑制更顯著。而成纖維細胞的主要功能是合成細胞外基質,其增殖受到抑制,不利于角膜成纖維細胞外基質的合成,可能使角膜進一步變薄,促進圓錐角膜病程的發展。本課題組前期研究發現,高幅度牽拉使角膜成纖維細胞中基質金屬蛋白(Matrix metallo proteinases)表達增加[13],表明高應變條件下基質合成受到影響,這與本文研究結果相符。有研究報道，對離體培養的人皮膚成纖維細胞施加拉伸幅度為30%的拉力,48 h后流式細胞儀檢測細胞周期,結果表明一定強度機械應力持續作用可促進皮膚成纖維細胞增殖[14];頻率為0.1 Hz、應變為5%的周期性機械拉伸作用24 h和36 h能夠促進兔角膜成纖維細胞增殖[15];對胎鼠肺成纖維細胞施加頻率為1 Hz,拉伸幅度為5%,15 min/h間歇性牽拉24 h,能夠抑制細胞增殖,并誘導其凋亡[16]。不同成纖維細胞在不同力的加載形式下，細胞增殖響應不統一,這可能與應力刺激的大小、頻率、時間、加載形式以及組織來源有關。圓錐角膜成

纖維細胞增殖在不同加載時間、加載方式、加載頻率下是如何響應的,還有待進一步深入研究。

本研究還發現,單獨作用TNF-α對人角膜成纖維細胞增殖無顯著影響,這與Mohan，et al[7]研究結果相一致。而TNF-α可抑制前列腺淋巴結癌(lymph node carcinoma of prostate,LNCaP)細胞的增殖[17],但可以促進人牙齦成纖維細胞的增殖[9],這說明不同來源的成纖維細胞對TNF-α反應有所不同。在TNF-α和5%周期性牽拉聯合作用時,KC2細胞增殖受到抑制,分析可知,這可能與患者的個體差異及病程有關。圓錐角膜患者1,發病10 a,病程進展緩慢。患者2在右眼發生圓錐角膜1 a后,左眼也迅速發展成圓錐角膜,屬于急性發病,因此他的角膜成纖維細胞在受到周期性牽拉和TNF-α作用時變化更顯著。本研究結果還表明,TNF-α與15%周期性牽拉聯合作用對角膜成纖維細胞增殖無協同效應。文獻報道，白細胞介素(IL-1β)抑制皮膚微血管細胞和關節軟骨細胞增殖,力學刺激促進皮膚微血管細胞和關節軟骨細胞增殖,力學刺激和IL-1β同時作用時則促進其細胞增殖[18-19]。高質量濃度的外源性炎癥介質前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)(100 ng/mL,500 ng/mL)能促進類風濕性關節炎中成纖維細胞樣滑膜細胞增殖,但力學刺激和PGE2共同作用時對滑膜細胞增殖的下調作用并不明顯[20]。可知炎性因子和力學刺激在影響細胞增殖時,它們之間的相互作用機制尚不明確。

角膜處在一個復雜的力學環境之中。本研究表明，在高應變或高應變與TNF-α聯合作用條件下,角膜成纖維細胞增殖受到抑制,進而影響細胞外基質合成,使角膜進一步變薄,促進圓錐角膜病程的發展。但角膜成纖維細胞如何感受應力變化和炎性因子,實現增殖調控，這還有待進一步深入研究。參考文獻：

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(編輯：張紅霞)

Effects of Cyclic Stretch and TNF-α on Cell Proliferation of Corneal Fibroblasts

YAO Yan1a,FENG Pengfei1b,LI Xiaona1b,HE Rui2,CHEN Weiyi1b,WANG Xiaojun1a

(1.a.CollegeofMechanics,b.InstituteofAppliedMechanicsandBiomedicalEngineering,TaiyuanUniversityofTechnology，Taiyuan030024,China;2.ExcimerLaserDepartment,ShanxiEyeHospital,Taiyuan030002,China)

Abstract:Corneal fibroblasts isolated from normal corneas and keratoconus in vitro were subjected to cyclic stretch (0.1 Hz,5% or 15% strain) using Flexcell 4000 tension system,in the presence of 1 ng/mL or 10 ng/mL tumor necrosis factor-α (TNF-α). Cell cycle was detected by flow cytometry,to study the effect of cyclic stretch and TNF-α on proliferation of fibroblasts in keratoconus corneas. The experiment result shows that,5% strain orTNF-α had no significant effects on S phase proportion of keratoconus and normal corneal fibroblasts. All groups’ S phase proportions of keratoconus and normal corneal fibroblasts decreased under 15% stretch. Compared with normal corneal fibroblasts,keratoconus fibroblasts decreased in S phase proportion more significantly under the effect of 15% stretch and TNF-α,and there is no difference between keratoconus groups. By this study,we know that cyclic stretch and TNF-α may promote the development of keratoconus by inhibiting the proliferation of corneal stromal cells.

Key words:cyclic stretch;tumor necrosis factor-α;keratoconus;fibroblasts;cell proliferation

中圖分類號:R318.01

文獻標識碼:A

DOI：10.16355/j.cnki.issn1007-9432tyut.2016.01.021

作者簡介：姚艷(1990-)，女，遼寧沈陽人，碩士生，主要從事生物力學研究，(E-mail)yaoyan199001@163.com通訊作者：王曉君(1974-)，女，博士，副教授，碩士生導師，(E-mail) wangxiaojun@tyut.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金資助項目:在體角膜材料生物力學特性研究及基于角膜微結構的建模分析(11402161)， 非糖基化交聯后基質剛度變化對角膜基質重塑的調控機理研究(11402162); 山西省高等學校教學改革資助項目(J2012014)

收稿日期：2015-03-18

文章編號:1007-9432(2016)01-0108-05