下調HEATR3表達對結直腸癌HCT116細胞增殖及Akt信號通路的影響

王倩，鮑永華,陳志國，楊萬才

(新鄉醫學院基礎醫學院，河南新鄉453003)

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下調HEATR3表達對結直腸癌HCT116細胞增殖及Akt信號通路的影響

王倩，鮑永華,陳志國，楊萬才

(新鄉醫學院基礎醫學院，河南新鄉453003)

摘要：目的觀察下調HEATR3表達對結直腸癌HCT116細胞增殖以及Akt信號通路的影響，探討HEATR3在結直腸癌中的作用。方法將HCT116細胞隨機分為觀察組和對照組，分別轉染HEATR3的干擾RNA及無義序列；采用MTT法檢測細胞增殖的光密度(OD)值，采用實時熒光定量PCR法檢測HEATR3 mRNA，Western blot法檢測HEATR3、Akt、p-Akt。結果兩組轉染前細胞增殖無差異，與對照組同時點比較，觀察組轉染后24、36、48 h時細胞增殖的OD值均降低(P均<0.05)；轉染48 h，觀察組HEATR3 mRNA及蛋白表達量分別為0.49±0.04、0.03±0.01，對照組分別為2.08±0.45、0.47±0.01，P均<0.05。觀察組Akt、p-Akt蛋白表達量分別為0.49±0.01、0.05±0.01，對照組分別為0.96±0.01、0.92±0.01，P均<0.05；結論下調HEATR3表達可通過抑制Akt信號通路降低結直腸癌細胞的增殖能力，HEATR3可能是結腸癌發生、發展中的一個重要癌基因。

關鍵詞：結直腸癌；HEATR3基因；細胞增殖；蛋白激酶B

結直腸癌(CRC)在美國居惡性腫瘤第3位，在腫瘤病死率中居第2位[1]。在中國，CRC在惡性腫瘤發病率中排第4位，并有上升的趨勢[2]。研究發現，CRC的發生、發展與抑癌基因的失活或表達下調以及癌基因的激活或表達上調相關，它們的改變會導致腫瘤信號通路的激活，如Wnt/β-catenin[3～5]、炎癥信號通路[6, 7]、Akt信號通路[8～10]等。HEATR3是近兩年通過高通量篩選發現的基因，目前對其了解甚少，只發現HEATR3與德系猶太人的克羅恩病發生相關[11]。2014年6～12月，我們針對HEATR3設計了高效的干擾RNA(siRNA)，觀察其對CRC細胞增殖以及Akt信號通路的影響，探討其在CRC中的作用。

1材料與方法

1.1材料人CRC細胞系HCT116購自中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所；HEATR3的siRNA及其無義序列(對照NC)由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成；RPMI 1640細胞培養基(Corning公司)，胰酶(上海碧云天生物技術有限公司)，胎牛血清(Thermo Fisher Scientific公司)；Western及IP細胞裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)；DMSO、MTT、逆轉錄試劑5X All-in-One RT Mastermix(ABM 公司)，TRIzol 試劑(Invitrogen公司)，EvaGreen qPCR Mastermix ROX(ABM公司)；Lipofectamine 3000(Invitrogen公司)；BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，ECL試劑(上海碧云天生物技術有限公司)；Akt抗體(Proteintech公司)，p-Akt、GAPDH抗體(Cell Signaling Technology公司)，HEATR3抗體(Proteintech公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養及轉染用RPMI 1640細胞培養基培養HCT116細胞，細胞培養箱溫度37 ℃、5% CO2、相對濕度95%。細胞傳代后用胰酶消化，接種至60 mm細胞培養皿和96孔板中；將細胞隨機分為觀察組和對照組，分別利用Lipofectamine 3000轉染HEATR3-siRNA和對照NC，按照試劑盒說明書操作。

1.2.2HEATR3 mRNA檢測采用實時熒光定量PCR法。轉染48 h，收集兩組細胞。以TRIzol試劑提取RNA，用NanoDrop 2000分光光度計檢測RNA濃度，-80 ℃保存。利用逆轉錄試劑盒5X All-in-One RT Mastermix對RNA進行逆轉錄，所得cDNA-80 ℃保存。通過primer3.0在線軟件設計引物：HEATR3上游引物5′-CTCCTCTCTCGGTGGTCTGT-3′，下游引物5′-CTCGGGTGCTGGAGCTTTTC-3′，片段長度191 bp；β-actin上游引物5′-CGCCAAGCACGATGAAGA-3′，下游引物5′-CTGTTGGAAGGTGGAAAGAGATG-3′，片段長度149 bp，引物由上海生工公司合成。利用EvaGreen qPCR Mastermix ROX熒光定量PCR試劑盒在StepOnePlus Real-Time PCR System上進行熒光定量PCR檢測，PCR體系及反應條件按照試劑盒說明書操作。每個標本重復3次，取平均Ct值，以2-ΔΔCt值表示mRNA表達水平。

1.2.3細胞增殖觀察采用MTT法。分別于轉染前(0 h)及轉染后24、36、48 h，向96孔板的細胞中加入MTT溶液10 μL，繼續培養4～6 h后除去細胞培養基；每孔加入100 μL DMSO溶液，輕輕振蕩10 min；待紫色結晶完全溶解后，置于多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)中，檢測570 nm波長下的光密度(OD)值，以此表示細胞增殖情況。

1.2.4HEATR3、Akt、p-Akt檢測采用Western blot法。收集60 mm培養皿中轉染48 h的細胞，加入Western及IP細胞裂解液提取蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。加入上樣緩沖液后煮蛋白5 min，采用Western blot法檢測HEATR3、Akt、p-Akt、GAPDH，應用全自動化學發光圖像分析系統(上海天能科技有限公司)和ECL溶液拍照并保存。通過Image J軟件分析條帶灰度值，以目的條帶與內參條帶灰度比值表示蛋白表達量。

2結果

2.1兩組HEATR3 mRNA及蛋白比較轉染48 h，觀察組HEATR3 mRNA及蛋白表達量分別為0.49±0.04、0.03±0.01，對照組分別為2.08±0.45、0.47±0.01，P均<0.05。

2.2兩組細胞增殖情況比較見表1。

表1　兩組細胞增殖情況比較±s)

注：與對照組同時點比較，*P<0.05。

2.3兩組Akt、p-Akt蛋白表達比較轉染48 h，觀察組Akt、p-Akt蛋白表達量分別為0.49±0.01、0.05±0.01，對照組分別為0.96±0.01、0.92±0.01，P均<0.05。

3討論

近年來研究發現，Akt信號通路可通過其下游信號轉導調控細胞凋亡和細胞周期，并且對端粒酶活性、腫瘤血管的生成以及腫瘤的侵襲有促進作用。因此，Akt信號通路在腫瘤的研究具有十分重要的意義。Akt可以通過對細胞周期的直接作用傳遞生存信號。通過使用PI3K抑制劑可以抑制CRC細胞系Colo205內Cyclin D的表達；而p-Akt可以逆轉PI3K抑制劑對Cyclin D的抑制作用，而且這種逆轉作用不能被PI3K抑制劑所拮抗；說明Akt可以促進Cyclin D的表達[11]。還有研究發現，Mdm2是Akt通路下游的一個作用底物，它可以特異性地被Akt磷酸化，從而使胞質中的Akt-Mdm2復合物迅速解離、Mdm2進入細胞核并與p53結合，進而促進p53降解并抑制其功能；而p53 則可以通過多種途徑影響細胞周期的進行[12]。另外，研究發現Akt與腫瘤永生化因子端粒酶逆轉錄酶催化亞基hTERT有關[13]。在黑色素細胞瘤細胞系SK-MEL28中發現，hTERT可能作為Akt的作用底物而被激活[14]。

HEATR3作為一種新發現的蛋白，其作用機制尚不清楚。目前，研究發現HEATR3與德系猶太人的克羅恩病發生相關，其通過激活NOD2信號通路從而對德系猶太人的克羅恩病發生起著促進作用[15]。而克羅恩病與CRC的發生密切相關，由此可以部分地支持本研究中HEATR3作為一種癌基因的觀點。本研究結果顯示，在HCT116細胞中下調HEATR3表達能夠明顯抑制Akt以及p-Akt的表達，從而通過Akt信號通路對CRC細胞的增殖起著重要的調節作用。今后我們將進一步研究HEATR3對于其他CRC細胞系的影響，并探討HEATR3影響CRC發生、發展的其他作用機制。

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Effects of down-regulating HEATR3 on proliferation of colorectal cancer cells HCT116 and Akt signaling pathway

WANGQian,BAOYonghua,CHENZhiguo,YANGWancai

(XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China)

Abstract:Objective To observe the effects of down-regulating HEATR3 on cell proliferation and Akt signaling pathway in colorectal cancer cell line HCT116, and to determine the role of HEATR3 in the colorectal cancer. MethodsHCT116 cells were randomly divided into the observation group and control group which were separately transfected with the siRNA of HEATR3 and nonsense sequence. The optical density (OD) value of cell proliferation was detected by MTT assay, the expression level of HEATR3 mRNA was detected by real-time fluorescent quantificative PCR, and the protein levels of HEATR3, Akt and p-Akt were detected by Western blotting. ResultsThere was no difference in the cell proliferation between the two group before transfection. The OD values of cell proliferation in the observation group were lower than those of the control group at 24 h, 36 h and 48 h after transfection (all P<0.05); the HEATR3 mRNA and protein levels in the observation group were 0.49±0.04, 0.03±0.01, and those were 2.08±0.45 and 0.47±0.01 in the control group at 48 h after transfection (all P<0.05). Akt and p-Akt protein levels in the observation group were 0.49±0.01 and 0.05±0.01, and those were 0.96±0.01 and 0.92±0.01 in the control group after transfection (all P<0.05). ConclusionThe down-regulation of HEATR3 can decrease the cell proliferation of colorectal cancer cells through inhibiting Akt signaling pathway, and HEATR3 may act as an important oncogene in the occurrence and development of colorectal cancer.

Key words:colorectal carcinoma; HEATR3 gene; cell proliferation; protein kinase B

(收稿日期：2015-12-01)

通信作者簡介：鮑永華(1976-)，女，教授，主要研究方向為腫瘤免疫。E-mail： baoyonghua2005@126.com

中圖分類號：R735.3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)10-0004-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.002

作者簡介：第一王倩(1988-)，女，在讀碩士，主要研究方向為腫瘤免疫。E-mail： wangqian88718@126.com

基金項目：國家自然科學基金重大研究計劃項目(91229115)；河南省腫瘤發生和轉移機制創新團隊(13IRTSTHN013)；

新鄉醫學院研究生科研創新支持計劃項目(YJSCX20408Z)。